Uso de tomografía computarizada de micro rayos X con preparación de ácido fosfotúrtico para visualizar el tejido fibromuscular humano
Summary
La tomografía computarizada de micro rayos X es eficaz para obtener información tridimensional de muestras humanas no dañadas, pero tiene un éxito limitado en la observación de tejidos blandos. El uso de agente de contraste de ácido fosfotúmético puede resolver este problema. Implementamos este agente de contraste para examinar los tejidos fibromusculares delicados humanos (el ligamento de retención orbicularis).
Abstract
La disección manual y la observación histológica son métodos comunes utilizados para investigar los tejidos humanos. Sin embargo, la disección manual puede dañar estructuras delicadas, mientras que el procesamiento y la observación histológica proporcionan información limitada a través de imágenes transversales. La tomografía computarizada de micro rayos X (microCT) es una herramienta eficaz para obtener información tridimensional sin dañar las muestras. Sin embargo, muestra una eficiencia limitada en la diferenciación de partes de tejido blando. El uso de agentes que mejoran el contraste, como el ácido fosfotúltico (PTA), puede resolver este problema mejorando el contraste de los tejidos blandos. Implementamos microCT con PTA para investigar el ligamento de retención orbicularis humano (ORL), que es una estructura delicada en el área de la órbita. En este método, los especímenes cosechados se fijan en formalina, se deshidratan en soluciones de etanol en serie y se tiñen con una solución de PTA. Después de la tinción, se realiza la exploración de microCT, la reconstrucción 3D y el análisis. La piel, los ligamentos y los músculos se pueden visualizar claramente utilizando este método. El tamaño de la muestra y la duración de la tinción son características esenciales del método. El espesor adecuado de la muestra fue de unos 5-7 mm, por encima de los cuales el proceso se desaceleró, y la duración óptima fue de 5-7 días, por debajo de los cuales ocasionalmente se producía un agujero vacío en el área central. Para mantener la ubicación y la dirección de las piezas pequeñas durante el corte, se recomienda coser en la misma región de cada pieza. Además, se necesitan análisis preliminares de la estructura anatómica para identificar correctamente cada pieza. El parafilm se puede utilizar para evitar el secado, pero se debe tener cuidado para evitar la distorsión de la muestra. Nuestra observación multidireccional mostró que el ORL se compone de una malla multicapa de placas continuas, en lugar de fibras similares a hilos, como se informó anteriormente. Estos resultados sugieren que la exploración por microCT con PTA es útil para examinar compartimentos específicos dentro de estructuras complejas de tejido humano. Puede ser útil en los análisis de tejidos cancerosos, tejidos nerviosos y varios órganos, como el corazón y el hígado.
Introduction
La disección manual y la observación histológica se utilizan normalmente para examinar los tejidos humanos, como los músculos y los tejidos conectivos. Sin embargo, la disección manual puede dañar fácilmente estructuras delicadas, y la observación histológica proporciona información limitada sobre superficies transversales planas1,2. Por lo tanto, se necesitan métodos mejorados para examinar los tejidos de manera más precisa y eficiente.
La tomografía computarizada convencional (TC) se utiliza generalmente en la práctica clínica, pero carece de la capacidad de distinguir estructuras pequeñas2,3. Micro Tc de rayos X (microCT) es una herramienta eficaz para obtener información tridimensional (3D) de pequeñas estructuras a partir de muestras, sin destruirlas. Sin embargo, la microCT tiene aplicaciones limitadas porque sólo los tejidos densos se pueden visualizar claramente; no se puede utilizar para diferenciar los tejidos blandos. Para superar esta limitación, se pueden utilizar agentes de tinción. Los agentes que mejoran el contraste, como el ácido fosfotúltico (PTA), el ácido fosfomolíbódico y el yodo de Lugol, mejoran la tasa de contraste de los tejidos blandos durante la exploración4,5. Varios estudios que comparan estos agentes sugieren que la PTA demuestra un buen rendimiento y es fácil de manejar6,7,8.
El ligamento de retención orbicular (ORL) es una estructura delicada alrededor de la órbita, que puede dañarse fácilmente durante la observación convencional9. Examinamos y recuperamos con éxito información 3D sobre esta estructura utilizando microCT con PTA como agente de contraste. Este método se puede aplicar a estudios sobre otros tejidos humanos, como el corazón y el hígado, con las modificaciones apropiadas10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Implementamos microCT con preparación de LA PTA en el examen de los tejidos blandos humanos. Brevemente, los especímenes se cosechan y fijan en formalina durante unos días, seguidos de la deshidratación en soluciones de etanol en serie. Colocar la muestra en la solución de la PTA directamente después de la fijación de la formalina puede resultar en algunos agrietamiento del tejido debido a la rápida deshidratación. Por lo tanto, se necesita deshidratación en serie antes de la tinción de la PTA. A continuación…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por una beca de investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei (6-2018-0099). Los autores agradecen a las personas que generosamente donaron sus cuerpos a la Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei. Agradecemos a Jun Ho Kim y Jong Ho Bang por su apoyo técnico (miembros del personal del Centro de Educación en Anatomía Quirúrgica del Colegio de Medicina de la Universidad de Yonsei). También estamos agradecidos a Genoss Co., Ltd. por el sistema de escaneo de microCT de alta calidad utilizado en esta investigación.
Materials
| 12 Tungsto(Ⅵ)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
Referências
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
