Summary

Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

Published: September 04, 2019
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Summary

La tecnología CRISPR-Cas9 proporciona un método eficiente para editar con precisión el genoma de mamíferos en cualquier tipo de célula y representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma. Aquí se proporciona un protocolo detallado que analiza los pasos necesarios para el buen rendimiento de las pantallas CRISPR-Cas9 agrupadas para todo el genoma.

Abstract

La edición del genoma utilizando el sistema CRISPR-Cas ha avanzado enormemente la capacidad de editar con precisión los genomas de varios organismos. En el contexto de las células de los mamíferos, esta tecnología representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma para estudios genómicos funcionales. Las bibliotecas de ARN guía (sgRNA) dirigidas a todos los marcos de lectura abiertos permiten la generación fácil de miles de perturbaciones genéticas en un solo grupo de células que se pueden analizar para fenotipos específicos para implicar la función génica y los procesos celulares en un manera imparcial y sistemática. Las pantallas CRISPR-Cas proporcionan a los investigadores un método simple, eficiente y económico para descubrir los planos genéticos de los fenotipos celulares. Además, el análisis diferencial de las pantallas realizadas en varias líneas celulares y de diferentes tipos de cáncer puede identificar genes que son esenciales desde el punto de vista contextual en las células tumorales, revelando objetivos potenciales para terapias específicas contra el cáncer. Realizar pantallas de todo el genoma en células humanas puede ser desalentador, ya que esto implica el manejo de decenas de millones de células y requiere el análisis de grandes conjuntos de datos. Los detalles de estas pantallas, como la caracterización de líneas celulares, las consideraciones de la biblioteca CRISPR y la comprensión de las limitaciones y capacidades de la tecnología CRISPR durante el análisis, a menudo se pasan por alto. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el rendimiento exitoso de las pantallas basadas en CRISPR-Cas9 en todo el genoma agrupado.

Introduction

CRISPR-Cas, abreviatura de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas y nucleasas asociadas a CRISPR, consiste en una única proteína de nucleasa (por ejemplo, Cas9) en complejo con un ARN guía sintético (sgRNA). Este complejo de ribonucleoproteínas se dirige a la enzima Cas9 para inducir roturas de ADN de doble cadena en un locus genómico específico1. Los cortes de doble cadena se pueden reparar mediante reparación dirigida por homología (HDR) o, más comúnmente, a través de unión final no homóloga (NHEJ), un mecanismo de reparación propenso a errores que da como resultado la inserción y/o deleciones (INDELS) que con frecuencia interrumpen la función génica 1. La eficiencia y simplicidad de CRISPR permite un nivel de segmentación genómica hasta ahora inalcanzable que supera con creces las tecnologías de edición del genoma anteriores [es decir, nucleasas de dedos de zinc (ZNF) o nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción ( TALENS), ambos sufren de mayor complejidad de diseño, menor eficiencia de transfección y limitaciones en la edición de genes multiplex2].

La aplicación básica de investigación de la edición del genoma basado en ARN de una sola guía de CRISPR ha permitido a los científicos interrogar de manera eficiente y económica las funciones de los genes individuales y la topología de las redes de interacción genética. La capacidad de realizar pantallas funcionales de todo el genoma se ha visto muy mejorada por el uso del sistema CRISPR-Cas, particularmente en comparación con tecnologías de perturbación genética anteriores, como la interferencia del ARN (ARN) y la mutagénesis de las trampas genéticas. En particular, el ARNi sufre de altos efectos fuera del objetivo y derribos incompletos, lo que resulta en una menor sensibilidad y especificidad en comparación con CRISPR3,4,5, mientras que los métodos de captura genética sólo son factibles en haploides células para pantallas de pérdida de funciones, limitando el alcance de los modelos de celda que se pueden interrogar6. La capacidad de CRISPR para generar un knock-out genético completo proporciona un sistema biológicamente más robusto para interrogar fenotipos mutantes, con bajo ruido, efectos mínimos fuera del objetivo y actividad constante a través de los reactivos5. Las bibliotecas de sgRNA CRISPR-Cas9 que se dirigen a todo el genoma humano están ahora ampliamente disponibles, permitiendo la generación simultánea de miles de noqueos genéticos en un solo experimento3,7,8,9 .

Hemos desarrollado bibliotecas lentivirales de sgRNA únicas para todo el genoma CRISPR-Cas9 llamadas las bibliotecas Toronto Knock-out (TKO) (disponibles a través de Addgene) que son compactas y están optimizadas para secuencias para facilitar pantallas genómicas funcionales de alta resolución. La última biblioteca, TKOv3, se dirige a 18.000 genes de codificación de proteínas humanas con 71.090 guías optimizadas para la eficiencia de edición utilizando datos empíricos10. Además, TKOv3 está disponible como una biblioteca de un componente (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) que expresa Cas9 y sgRNAs en un solo vector, aliviando la necesidad de generar células estables de expresión de Cas9, lo que permite el desconexión del genoma en una amplia gama de tipos de células de mamíferos. TKOv3 también está disponible en un vector sin Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID 125517) y se puede utilizar en celdas que expresan Cas911.

Una población celular editada por CRISPR-Cas9 en todo el genoma puede estar expuesta a diferentes condiciones de crecimiento, con la abundancia de sgRNA a lo largo del tiempo cuantificada por la secuenciación de próxima generación, proporcionando una lectura para evaluar la deserción o el enriquecimiento de células con Perturbaciones. Las bibliotecas CRISPR knock-out se pueden aprovechar para identificar genes que, tras la perturbación, causan defectos de aptitud celular, sensibilidad moderada a los medicamentos (por ejemplo, genes sensibles o resistentes), regulan la expresión de proteínas (por ejemplo, reportero), o son necesarios para un determinado función de la vía y estado celular12,13,14. Por ejemplo, las pantallas de aptitud diferencial en una línea celular cancerosa pueden identificar tanto el agotamiento o la reducción de oncogenes como el enriquecimiento o un aumento de los genes supresores tumorales3,14,15. Del mismo modo, el uso de dosis intermedias de fármacos terapéuticos puede revelar tanto la resistencia a los fármacos como los genes de sensibilización16,17.

Aquí se proporciona un protocolo de cribado detallado para la detección de la pérdida de función CRISPR-Cas9 a escala del genoma utilizando las bibliotecas Knock-out de Toronto (TKOv1 o v3) en células de mamíferos desde la generación de bibliotecas, el rendimiento de cribado hasta el análisis de datos. Aunque este protocolo se ha optimizado para su detección con las bibliotecas Knock-out de Toronto, se puede aplicar y convertirse en escalable para todas las bibliotecas agrupadas de SgRNA de CRISPR.

Protocol

Los experimentos descritos a continuación deben seguir las directrices de la Oficina de Seguridad y Salud Ambiental del instituto. 1. Amplificación de plásmido de plásmido de biblioteca lentiviral CRISPR sgRNA agrupada Diluir la biblioteca de ADN de plásmido CRISPR sgRNA ya hecha a 50 ng/L en TE (por ejemplo, TKOv3). Electroportar la biblioteca utilizando células electrocompetentes. Configure un total de cuatro reacciones de electroporación como se describe a continu…

Representative Results

Descripción general del flujo de trabajo de cribado CRISPR a escala del genoma La Figura 1 ilustra una visión general del flujo de trabajo de cribado CRISPR agrupado, comenzando con la infección de las células diana con lentivirus de la biblioteca CRISPR a un MOI bajo para garantizar eventos de integración única y una representación adecuada de la biblioteca (normalmente de 2…

Discussion

Debido a su simplicidad de uso y alta flexibilidad, la tecnología CRISPR ha sido ampliamente adoptada como la herramienta de elección para la edición precisa del genoma. El cribado CRISPR agrupado proporciona un método para interrogar miles de perturbaciones genéticas en un solo experimento. En las pantallas agrupadas, las bibliotecas sgRNA sirven como códigos de barras moleculares, ya que cada secuencia es única y se asigna al gen objetivo. Al aislar el ADN genómico de la población celular, los genes que causan…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Genoma Canadá, el Fondo de Investigación de Ontario y los Institutos Canadienses para la Investigación Sanitaria (MOP-142375, PJT-148802).

Materials

0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl Promega V4221
50X TAE buffer BioShop TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution BioShop HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue ThermoFisher Scientific DAL1025
Blue-light transilluminator ThermoFisher Scientific G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade Bioshop ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium Life Technologies 11995-065 Cel culture media
Electroporation cuvettes BTX 45-0134
Electroporator BTX 45-0651
Endura electrocompetent cells Lucigen 90293
Fetal Bovine Serum GIBCO 12483-020
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216 recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) Sigma H9268 Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder New England Biolabs N3233S
Nanodrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544L
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit Qiagen 12963
pMD2.G (envelope plasmid) Addgene Plasmid #12259 lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid) Addgene Plasmid #12260 lentiviral system
Puromycin Wisent 400-160-UG
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
Qubit dsDNA BR assay ThermoFisher Scientific Q32853
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33226
RNAse A Invitrogen 12091021
S.O.C recovery medium Invitrogen 15544034
SYRB Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included Addgene Addgene ID #90203 Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 Addgene Addgene ID #125517 Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose ThermoFisher Scientific 16500500
Wizard genomic DNA purification kit Promega A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 06 365 809 001 Lipid based transfection reagent

Referências

  1. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
  2. Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
  3. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  4. Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
  5. Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  6. Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
  7. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  8. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  9. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
  12. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
  15. Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
  16. Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
  17. Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
  18. Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
  19. Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
  20. Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
  21. Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
  22. Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
  23. Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
  24. Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
  25. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
  26. Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
  27. Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
  28. Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).

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Citar este artigo
Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).

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