Samlede CRISPR-baserede genetiske skærme i pattedyrsceller
Summary
Crispr-Cas9-teknologien er en effektiv metode til præcist at redigere pattedyrs genomet i en hvilken som helst celletype og udgør et nyt middel til at udføre genom-dækkende genetiske skærme. Her er en detaljeret protokol, der diskuterer de nødvendige skridt til en vellykket udførelse af poolede Genome-Wide CRISPR-Cas9-skærme.
Abstract
Genomredigering ved hjælp af CRISPR-CAS systemet har langt fremme evnen til præcist at redigere genomer af forskellige organismer. I forbindelse med pattedyrsceller udgør denne teknologi et nyt middel til at udføre Genome-dækkende genetiske skærme til funktionelle genomforskning. Biblioteker for guide RNAs (sgRNA), der er rettet mod alle åbne læse rammer, tillader, at der fremstilles tusindvis af genetiske forstyrrelser i en enkelt pulje af celler, som kan screenes for specifikke fænotyper for at involvere genfunktion og cellulære processer i en upartisk og systematisk måde. Crispr-CAS-skærme giver forskerne en enkel, effektiv og billig metode til at afdække de genetiske tegninger for cellulære fænotyper. Endvidere, differentiel analyse af skærme udført i forskellige cellelinjer og fra forskellige kræfttyper kan identificere gener, der er kontekstuelt væsentlige i tumorceller, afsløre potentielle mål for specifikke anticancer behandlinger. Udførelse af genomdækkende skærme i humane celler kan være skræmmende, da dette indebærer håndtering af snesevis af millioner af celler og kræver analyse af store datasæt. Detaljerne i disse skærme, såsom cellelinje karakterisering, CRISPR Library overvejelser, og forståelse af begrænsningerne og mulighederne i CRISPR teknologi under analyse, er ofte overset. Forudsat her er en detaljeret protokol for en vellykket præstation af poolede Genome-Wide CRISPR-Cas9 baserede skærme.
Introduction
CRISPR-CAS, kort til klyngeopdelte korte palindromiske gentagelser og CRISPR-associeret nuclease, består af et enkelt nukleaseprotein (f. eks. Cas9) i kompleks med et syntetisk guide-RNA (sgRNA). Dette ribonucleoprotein-kompleks er rettet mod Cas9-enzymet for at fremkalde dobbeltstrenget DNA-pauser ved en specifik genomlocus1. Dobbelt-strandede pauser kan repareres via homologi instrueret Repair (HDR) eller, mere almindeligt, gennem ikke-homologous end-sammenslutning (nhej), en fejlbehæftet reparations mekanisme, der resulterer i indsættelse og/eller sletninger (indeler), der ofte forstyrrer genfunktion 1. den effektivitet og enkelhed crispr gør det muligt for et tidligere uopnåeligt niveau af genomisk målretning, der langt overgår tidligere genomredigering teknologier [dvs., zink finger nucleaser (znf) eller transkriptionsaktivator-lignende Effector nucleaser ( Talens), som begge lider af øget design kompleksitet, lavere transfektering effektivitet, og begrænsninger i multiplex gen redigering2].
Den grundlæggende forskning anvendelse af CRISPR single-guide RNA-baserede genomredigering har gjort det muligt for videnskabsfolk til effektivt og billigt at afhøre de funktioner af individuelle gener og topologi af genetiske interaktion netværk. Evnen til at udføre funktionelle genomdækkende skærme er blevet stærkt forbedret ved brug af CRISPR-CAS-systemet, især i sammenligning med tidligere genetiske perturbationsteknologier såsom RNA-interferens (RNAi) og mutagenese af gen Trap. RNAi lider især af høje off-Target effekter og ufuldstændig Knockdown, hvilket resulterer i lavere følsomhed og specificitet i forhold til crispr3,4,5, mens gentrap metoder er kun muligt i haploide celler til tab af funktions skærme, hvilket begrænser omfanget af cellemodeller, der kan afhøres6. CRISPR ‘s evne til at generere komplet gen-knock-out giver et mere biologisk robust system til at afhøre mutant fænotyper med lav støj, minimal off-Target effekter og konsekvent aktivitet på tværs af reagenser5. Crispr-Cas9 sgrna biblioteker, der er rettet mod hele det menneskelige genom, er nu alment tilgængelige, hvilket giver mulighed for samtidig generering af tusinder af gen-Knock-outs i et enkelt eksperiment3,7,8,9 .
Vi har udviklet unikke crispr-Cas9 Genome-Wide sgrna lentiviral biblioteker kaldet Toronto knock-out (TKO) biblioteker (tilgængelige via addgene), der er kompakte og sekvens-optimeret til at lette høj opløsning funktionelle genomforskning skærme. Det seneste bibliotek, TKOv3, mål ~ 18.000 humane protein-kodning gener med 71.090 guider optimeret til redigering effektivitet ved hjælp af empiriske data10. Derudover er TKOv3 tilgængelig som et One-Component Library (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294), der udtrykker Cas9 og sgRNAs på en enkelt vektor, hvilket mindsker behovet for at generere stabile Cas9-ekspression celler, hvilket muliggør Genome-dækkende knock-out på tværs af en bred vifte af pattedyrscelle typer. TKOv3 er også tilgængelig i en vektor uden Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) og kan udnyttes i celler, der udtrykker Cas911.
En genomdækkende CRISPR-Cas9-redigeret cellepopulation kan eksponeres for forskellige vækstforhold, med den overflod af sgRNAs med tiden, der er kvantificeret ved næste generations sekvensering, og som giver en aflæsning til at vurdere frafald eller berigelse af celler med sporbare genetiske forstyrrelser. CRISPR knock-out biblioteker kan udnyttes til at identificere gener, der ved perturbation, forårsage cellulære konditions defekter, moderat lægemiddel følsomhed (f. eks. følsomme eller resistente gener), regulere protein ekspression (f. eks. reporter) eller er påkrævet for en bestemt pathway funktion og cellulær tilstand12,13,14. For eksempel kan differentiale fitness skærme i en Cancer cellelinje identificere både nedbrydning eller reduktion af onkogener og berigelse eller en stigning af tumor suppressorer gener3,14,15. Tilsvarende, ved hjælp af mellemliggende doser af terapeutiske lægemidler kan afsløre både narkotika resistens og sensibilisering gener16,17.
Forudsat her er en detaljeret screening protokol for genom-skala CRISPR-Cas9 tab-of-funktion screening ved hjælp af Toronto knock-out biblioteker (TKOv1 eller v3) i pattedyrceller fra bibliotek generation, screening ydeevne til dataanalyse. Selv om denne protokol er blevet optimeret til screening ved hjælp af Toronto knock-out biblioteker, kan den anvendes og blive skalerbar til alle CRISPR sgRNA poolede biblioteker.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af sin enkelhed i brug og høj smidighed, er crispr teknologi blevet bredt vedtaget som det foretrukne værktøj til præcis genom redigering. Samlet CRISPR-screening giver en metode til at afhøre tusinder af genetiske forstyrrelser i et enkelt eksperiment. I poolede skærme fungerer sgRNA Libraries som molekylære stregkoder, da hver sekvens er unik og er knyttet til det målrettede gen. Ved at isolere det genomiske DNA fra celle populationen kan gener, der forårsager fænotype af interesse, bestemmes ved at…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Genome Canada, Ontario Research fund, og de canadiske institutter for sundhedsforskning (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
Referências
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
- Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
