Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos
Summary
A tecnologia CRISPR-Cas9 fornece um método eficiente para editar precisamente o genoma dos mamíferos em qualquer tipo de célula e representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma. Um protocolo detalhado que discute as etapas necessárias para o desempenho bem-sucedido de telas de CRISPR-Cas9 agrupadas em todo o genoma é fornecido aqui.
Abstract
A edição do genoma usando o sistema CRISPR-CAS avançou enormente a capacidade de editar precisamente os genomas de vários organismos. No contexto das células de mamíferos, esta tecnologia representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma para estudos de genômica funcional. Bibliotecas de guia RNAs (sgRNA) visando todos os quadros de leitura aberta permitem a geração facile de milhares de perturbações genéticas em um único pool de células que podem ser rastreados para fenótipos específicos para implicar a função gênica e processos celulares em um forma imparcial e sistemática. As telas CRISPR-CAS fornecem aos pesquisadores um método simples, eficiente e barato para descobrir os esquemas genéticos para fenótipos celulares. Além disso, a análise diferencial de telas realizadas em várias linhagens celulares e de diferentes tipos de câncer pode identificar genes que são contextualmente essenciais nas células tumorais, revelando potenciais alvos para terapias anticâncer específicas. A realização de telas de todo o genoma em células humanas pode ser assustadora, pois isso envolve o manuseio de dezenas de milhões de células e requer a análise de grandes conjuntos de dados. Os detalhes dessas telas, como a caracterização da linha celular, as considerações da biblioteca CRISPR e a compreensão das limitações e capacidades da tecnologia CRISPR durante a análise, são muitas vezes negligenciadas. Aqui é fornecido um protocolo detalhado para o desempenho bem-sucedido de telas baseadas em agregados de CRISPR-Cas9 em todo o genoma.
Introduction
CRISPR-CAS, abreviação de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente e nuclease associada a CRISPR, consiste em uma única proteína nuclease (por exemplo, Cas9) em complexo com um RNA guia sintético (sgRNA). Este complexo de ribonucleoproteína tem como alvo a enzima Cas9 para induzir quebras de DNA de dupla cadeia em um locus genómico específico1. As rupturas dobro-encalhado podem ser reparadas através da reparação dirigida homologia (HDR) ou, mais geralmente, com a junção não-homóloga da extremidade (nhej), um mecanismo de reparo propenso ao erro que resulte na inserção e/ou nos deleções (indels) que interrompem freqüentemente a função do gene a eficiência 1. The e a simplicidade de crispr permitem um nível previamente inatingível da segmentação genomic que ultrapassa distante tecnologias precedentes da edição do genoma [isto é, nucleases do dedo do zinco (ZNF) ou a transcrição ativador-como nucleases do efetoras ( TALENS), ambos sofrem de complexidade de design aumentada, menor eficiência de transfecção e limitações na edição de genes multiplex2].
A aplicação básica da pesquisa da edição do genoma RNA-baseada do único-guia de CRISPR permitiu que os cientistas interrogue eficientemente e barata as funções de genes individuais e topologia de redes genéticas da interação. A habilidade de executar telas funcionais do genoma-largo foi aumentada extremamente pelo uso do sistema de crispr-CAS, particular quando comparado às tecnologias genéticas mais adiantadas do perturbação tais como a interferência do RNA (RNAi) e a mutagenese da armadilha do gene. Em particular, RNAi sofre de efeitos off-Target elevados e knockdown incompleto, resultando em menor sensibilidade e especificidade em comparação com crispr3,4,5, enquanto os métodos de armadilha genética só são viáveis em haplóides células para telas de perda de função, limitando o escopo de modelos de células que podem ser interrogados6. A capacidade de CRISPR para gerar o knock-out completo do gene fornece um sistema mais biologicamente robusto para interrogar fenótipos mutantes, com baixo ruído, efeitos mínimos fora do alvo e atividade consistente em todos os reagentes5. As bibliotecas de crispr-Cas9 sgrna que visam todo o genoma humano estão agora amplamente disponíveis, permitindo a geração simultânea de milhares de knock-outs de genesem um único experimento3,7,8,9 .
Desenvolvemos bibliotecas de lentivirais sgRNA em todo o genoma CRISPR-Cas9, denominadas bibliotecas de Toronto knock-out (TKO) (disponíveis através do Addgene) que são compactas e otimizadas para sequências para facilitar telas de genômica funcional de alta resolução. A mais recente biblioteca, TKOv3, alvos ~ 18.000 genes de codificação de proteínas humanas com 71.090 guias otimizados para a eficiência de edição usando dados empíricos10. Além disso, TKOv3 está disponível como uma biblioteca de um componente (LCV2:: TKOv3, ID de Addgene #90294) expressando Cas9 e sgRNAs em um único vetor, aliviando a necessidade de gerar células de expressão de Cas9 estáveis, permitindo knock-out em todo o genoma em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. TKOv3 também está disponível em um vetor sem Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) e pode ser utilizado em células que expressam Cas911.
Uma população de células editada em todo o genoma CRISPR-Cas9 pode ser exposta a diferentes condições de crescimento, com a abundância de sgRNAs ao longo do tempo quantificada por sequenciamento de próxima geração, proporcionando uma leitura para avaliar o abandono ou enriquecimento de células com genética rastreável Perturbações. As bibliotecas de knock-out CRISPR podem ser aproveitadas para identificar genes que, após a perturbação, causam defeitos de aptidão celular, sensibilidade moderada à droga (por exemplo, genes sensíveis ou resistentes), regulam a expressão protéica (por exemplo, repórter), ou são necessários para um certo função do caminho e estado celular12,13,14. Por exemplo, as telas diferenciais de aptidão em uma linha celular cancerosa podem identificar tanto depleção ou redução de oncogenes e enriquecimento ou um aumento dos genes supressores de tumor3,14,15. Da mesma forma, o uso de doses intermediárias de fármacos terapêuticos pode revelargenes de resistênciae sensibilização dos fármacos16,17.
Aqui é fornecido um protocolo detalhado de triagem para a triagem de perda de função de CRISPR-Cas9 em escala de genoma usando as bibliotecas de Toronto knock-out (TKOv1 ou V3) em células de mamíferos de geração de biblioteca, desempenho de triagem para análise de dados. Embora esse protocolo tenha sido otimizado para triagem usando as bibliotecas de knock-out de Toronto, ele pode ser aplicado e tornar-se escalável para todas as bibliotecas agrupadas do sgRNA CRISPR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido à sua simplicidade de uso e alta maleabilidade, a tecnologia CRISPR tem sido amplamente adotada como a ferramenta de escolha para a edição precisa do genoma. A triagem de CRISPR agrupada fornece um método para interrogar milhares de perturbações genéticas em um único experimento. Em telas agrupadas, as bibliotecas sgRNA servem como códigos de barras moleculares, pois cada sequência é única e é mapeada para o gene alvo. Isolando o ADN genomic da população da pilha, os genes que causam o phenotype do …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo genoma do Canadá, o fundo de investigação de Ontário, e os institutos canadenses de pesquisa em saúde (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
Referências
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