Poolade CRISPR-baserade genetiska skärmar i däggdjursceller
Summary
CRISPR-Cas9 teknik ger en effektiv metod för att exakt redigera däggdjur arvsmassan i någon celltyp och representerar ett nytt sätt att utföra genomomfattande genetiska skärmar. Ett detaljerat protokoll som diskuterar de steg som krävs för lyckad prestanda av poolade genomhela CRISPR-Cas9 skärmar finns här.
Abstract
Genom redigering med hjälp av CRISPR-CAS-systemet har mycket avancerat förmågan att exakt redigera arvsmassan hos olika organismer. I samband med däggdjursceller utgör denna teknik ett nytt sätt att utföra genetiska skärmar av genomomfattande form för funktionella genomik-studier. Bibliotek av guide RNAs (sgRNA) som riktar sig till alla öppna läsramar tillåter den facile generationen av tusentals genetiska störningar i en enda pool av celler som kan screenas för specifika fenotyper att implikera genfunktion och cellulära processer i en opartisk och systematisk sätt. CRISPR-CAS skärmar ger forskarna en enkel, effektiv och billig metod för att avslöja den genetiska ritningar för cellulära fenotyper. Dessutom kan differentiell analys av skärmar som utförs i olika cellinjer och från olika cancertyper identifiera gener som är kontextuellt viktiga i tumörceller, avslöjar potentiella mål för specifika cancerbehandlingar. Att utföra genomomfattande skärmar i mänskliga celler kan vara skrämmande, eftersom detta innebär hantering av tiotals miljoner celler och kräver analys av stora mängder data. Detaljerna för dessa skärmar, till exempel cellinskarakterisering, CRISPR-biblioteksöverväganden och förståelse av CRISPR-teknikens begränsningar och möjligheter under analys, förbises ofta. Här finns ett detaljerat protokoll för lyckad prestanda av poolade genomhela CRISPR-Cas9 baserade skärmar.
Introduction
CRISPR-CAS, kort för grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom repetitioner och CRISPR-associerade Nuclease, består av ett enda nukleasprotein (t. ex., Cas9) i komplex med en syntetisk guide RNA (sgrna). Detta ribonukleoprotein Complex riktar sig till Cas9 enzym för att inducera dubbelsträngade DNA-brott vid en specifik genomisk Locus1. Dubbel-strandsatta raster kan repareras via homologi riktad reparation (HDR) eller, mer allmänt, genom icke-homolog sammanfogning (nhej), en felbenägna reparationsmekanism som resulterar i införande och/eller borttagningar (indels) som ofta stör genfunktion 1. den effektivitet och enkelhet CRISPR möjliggör en tidigare ouppnåelig nivå av genomisk inriktning som vida överträffar tidigare genom redigering teknik [i.e., zink finger nukleaser (ZNF) eller transkription Activator-liknande effektor nukleaser ( TALENS), som båda lider av ökad design komplexitet, lägre transfektion effektivitet, och begränsningar i multiplex genredigering2].
Den grundläggande forskningen tillämpning av CRISPR Single-guide RNA-baserad genom redigering har gjort det möjligt för forskare att effektivt och billigt förhöra funktionerna i enskilda gener och topologi av genetiska interaktioner nätverk. Förmågan att utföra funktionella genom-wide skärmar har förbättrats avsevärt genom användning av CRISPR-CAS-systemet, särskilt jämfört med tidigare genetiska störningar teknik såsom RNA-interferens (RNAi) och Gene trap mutagenes. I synnerhet lider RNAi av höga off-Target effekter och ofullständig knockdown, vilket resulterar i lägre känslighet och specificitet jämfört med CRISPR3,4,5, medan gen fällor metoder är endast möjligt i haploida celler för förlust av funktion skärmar, begränsa omfattningen av cellmodeller som kan förhörs6. CRISPR förmåga att generera fullständig Gene Knock-Out ger ett mer biologiskt robust system för att förhöra muterade fenotyper, med låg ljudnivå, minimal off-mål effekter och konsekvent aktivitet över reagenser5. CRISPR-Cas9 sgrna-bibliotek som riktar sig till hela människans arvsmassa är nu allmänt tillgängliga, vilket möjliggör samtidig generering av tusentals genknock-outs i ett enda experiment3,7,8,9 .
Vi har utvecklat unika CRISPR-Cas9 genom-omfattande sgRNA lentivirala bibliotek som kallas Toronto knock-out (TKO) bibliotek (tillgängliga via Addgene) som är kompakta och sekvens-optimerade för att underlätta högupplöst funktionell Genomics skärmar. Det senaste biblioteket, TKOv3, mål ~ 18 000 Human protein-kodning gener med 71 090 guider optimerad för redigering effektivitet med hjälp av empiriska data10. Dessutom är TKOv3 tillgänglig som en en-komponent bibliotek (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294) uttrycker Cas9 och sgRNAs på en enda vektor, att lindra behovet av att generera stabila Cas9-uttrycker celler, vilket möjliggör genombrett knock-out över ett brett spektrum av däggdjurscell typer. TKOv3 finns även i en vektor utan Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) och kan utnyttjas i celler som uttrycker Cas911.
En genombred, CRISPR-Cas9-redigerad cellpopulation kan exponeras för olika tillväxtförhållanden, med överflödet av sgRNAs över tid som kvantifierats genom nästa generations sekvensering, vilket ger en avläsning för att bedöma avhopp eller berikning av celler med spårbar genetisk Störningar. CRISPR knock-out bibliotek kan utnyttjas för att identifiera gener som vid störning, orsaka cellulära Fitness defekter, måttlig läkemedels känslighet (t. ex. känsliga eller resistenta gener), reglera proteinuttryck (t. ex., reporter), eller krävs för en viss Pathway funktion och cellulära tillstånd12,13,14. Till exempel, differentiell Fitness skärmar i en cancer cell linje kan identifiera både utarmning eller minskning av onkogener och berikning eller en ökning av tumör dämpning gener3,14,15. På samma sätt, med hjälp av mellanliggande doser av terapeutiska läkemedel kan avslöja både läkemedelsresistens och sensibilisering gener16,17.
Tillhandahålls här är ett detaljerat screening protokoll för genomskala CRISPR-Cas9 förlust-av-funktion screening med Toronto knock-out bibliotek (TKOv1 eller v3) i däggdjursceller från bibliotek generation, screening prestanda till dataanalys. Även om detta protokoll har optimerats för screening med Toronto knock-out bibliotek, det kan tillämpas och bli skalbar till alla CRISPR sgRNA poolade bibliotek.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av sin enkelhet i användning och hög följbarhet, CRISPR teknik har allmänt antagits som verktyg för val för exakt genomredigering. Poolade CRISPR screening ger en metod för att förhöra tusentals genetiska störningar i ett enda experiment. I poolade skärmar fungerar sgRNA-biblioteken som molekylära streckkoder, eftersom varje sekvens är unik och mappas till den riktade genen. Genom att isolera det genomiska DNA från cellpopulationen kan gener som orsakar fenotypen av intresse bestämmas genom att k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av arvsmassa Kanada, Ontarios forskningsfond och de kanadensiska instituten för hälsoforskning (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
Referências
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
- Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
