Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar
Summary
CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.
Abstract
CRISPR-Cas sistemini kullanarak genom düzenleme, çeşitli organizmaların genomlarını tam olarak düzenleme yeteneğini büyük ölçüde ilerletmiştir. Memeli hücreleri bağlamında, bu teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç temsil eder. Tüm açık okuma çerçevelerini hedefleyen kılavuz RNA’ların (sgRNA) kütüphaneleri, gen fonksiyonunu ve hücresel süreçleri bir tarafsız ve sistematik bir şekilde. CRISPR-Cas ekranlar, araştırmacılara hücresel fenotiplerin genetik planlarını ortaya çıkarmak için basit, verimli ve ucuz bir yöntem sunar. Ayrıca, çeşitli hücre hatları ve farklı kanser türlerinde gerçekleştirilen ekranların diferansiyel analizi tümör hücrelerinde bağlamsal olarak gerekli olan genleri belirleyebilir, belirli antikanser tedavileri için potansiyel hedefleri ortaya koymaktadır. İnsan hücrelerinde genom genişliğinde ekranlar yapmak göz korkutucu olabilir, çünkü bu on milyonlarca hücrenin işlenmesini gerektirir ve büyük veri kümelerinin analizini gerektirir. Hücre satırı karakterizasyonu, CRISPR kitaplık konuları ve analiz sırasında CRISPR teknolojisinin sınırlamalarını ve yeteneklerini anlama gibi bu ekranların ayrıntıları genellikle göz ardı edilir. Burada havuzlu genom çapında CRISPR-Cas9 tabanlı ekranların başarılı performans için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.
Introduction
CRISPR-Cas, kümelenmiş düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar ve CRISPR ilişkili nükleaz ın kısaltması, sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) ile kompleks halinde tek bir nükleaz proteininden (örn. Cas9) oluşur. Bu ribonükleoprotein kompleksi Cas9 enzimini hedef alarak belirli bir genomik lokus1’deçift iplikçikli DNA kırıklarına neden olur. Çift iplikli molalar homoloji yönelimli onarım (HDR) veya daha yaygın olarak, homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yoluyla onarılabilir, sık sık gen fonksiyonunu bozan ekleme ve/veya silme (INDELS) ile sonuçlanan hataya açık bir onarım mekanizması 1. CRISPR’ın etkinliği ve basitliği, önceki genom düzenleme teknolojilerini (örneğin, çinko parmak çekirdekleri (ZNF) veya transkripsiyon aktivatör benzeri efektör çekirdekleri aşan daha önce ulaşılmaz bir genomik hedefleme düzeyisağlar ( TALENS), her ikisi de artan tasarım karmaşıklığı muzdarip, düşük transfection verimliliği, ve multipleks gen düzenleme sınırlamaları2].
CRISPR tek kılavuzLu RNA tabanlı genom düzenleme temel araştırma uygulaması bilim adamları verimli ve ucuza bireysel genlerin işlevlerini ve genetik etkileşim ağlarının topoloji sorgulamak için izin verdi. Özellikle RNA paraziti (RNAi) ve gen kapanı mutagenezi gibi daha önceki genetik pertürbasyon teknolojileri ile karşılaştırıldığında, crispr-Cas sisteminin kullanımı yla fonksiyonel genom çapındaki ekranlar gerçekleştirebilme yeteneği büyük ölçüde artırılmıştır. Özellikle, RNAi yüksek off-hedef etkileri ve eksik nakavt muzdarip, CRISPR göre daha düşük duyarlılık ve özgüllük sonuçlanan3,4,5, gen tuzak yöntemleri haploid sadece uygulanabilir iken fonksiyon kaybı ekranlar için hücreler, sorgulanabilir hücre modellerinin kapsamını sınırlayan6. CRISPR’ın tam gen nakavtı üretme yeteneği, mutant fenotipleri sorgulamak için daha biyolojik olarak sağlam bir sistem sağlar, düşük gürültü, minimum hedef dışı etkiler ve reaktifler arasında tutarlı aktivite5. Tüm insan genomunu hedefleyen CRISPR-Cas9 sgRNA kütüphaneleri artık yaygın olarak mevcuttur, tek bir deneyde binlerce gen nakavtının aynı anda üretilmesine izinverir 3,7,8,9 .
Toronto Knock-out (TKO) kütüphaneleri (Addgene aracılığıyla temin edilebilir) adı verilen ve yüksek çözünürlüklü genomik ekranları kolaylaştırmak için kompakt ve dizi optimize edilmiş benzersiz CRISPR-Cas9 genom çapındaki sgRNA lentiviral kütüphaneler geliştirdik. En son kütüphane, TKOv3, hedef ~ 18,000 insan protein kodlama genleri ile 71.090 kılavuzları ampirik veri10kullanarak düzenleme verimliliği için optimize edilmiştir. Buna ek olarak, TKOv3 tek bileşenli bir kütüphane olarak kullanılabilir (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) tek bir vektör üzerinde Cas9 ve sgRNA’ları ifade ederek, geniş bir yelpazede genom çapında nakavt sağlayan, kararlı Cas9 ifade eden hücreler üretme ihtiyacını hafifleterek memeli hücre tipleri. TKOv3 cas9 olmadan bir vektör de mevcuttur (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID # 125517) ve Cas911ifade hücrelerde kullanılabilir.
Genom çapında crispr-Cas9 düzenlenmiş hücre popülasyonu farklı büyüme koşullarına maruz kalabilir, zaman içinde sgRNA bolluğu yeni nesil sıralama ile ölçülür, izlenebilir genetik hücrelerin terk veya zenginleşmesi değerlendirmek için bir okuma sağlayan tedirginlikler. CRISPR nakavt kütüphaneleri, tedirginlik üzerine hücresel fitness bozukluklarına, orta derecede ilaç duyarlılığına (örneğin, hassas veya dirençli genler) neden olan, protein ekspresyonunu (örn. muhabir) düzenleyen veya belirli bir yol fonksiyonu ve hücresel durum12,13,14. Örneğin, bir kanser hücresi hattında diferansiyel fitness ekranları hem tükenmesi veya onkogenlerin azaltılması ve zenginleştirme veya tümör bastırıcıgenler genlerin bir artış tespit edebilirsiniz3,14,15. Benzer şekilde, terapötik ilaçların ara dozlarda kullanarak hem ilaç direnci ve duyarlılık genleri ortaya çıkarabilir16,17.
Burada verilen genom ölçekli CRISPR-Cas9 fonksiyon kaybı tarama için ayrıntılı bir tarama protokolü Toronto Knock-out kütüphaneleri kullanarak (TKOv1 veya v3) kütüphane nesil memeli hücrelerde, veri analizi için tarama performansı. Bu protokol Toronto Knock-out kitaplıkları kullanılarak tarama için optimize edilmiş olsa da, uygulanabilir ve tüm CRISPR sgRNA havuzlu kütüphaneler için ölçeklenebilir hale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kullanım kolaylığı ve yüksek esnekliği sayesinde CRISPR teknolojisi hassas genom düzenleme için tercih edilen bir araç olarak yaygın olarak benimsenmiştir. Havuzlu CRISPR taraması, tek bir deneyde binlerce genetik tedirginliği sorgulamak için bir yöntem sağlar. Havuzlu ekranlarda, sgRNA kitaplıkları moleküler barkod görevi görehizmet eder, çünkü her dizi benzersizdir ve hedeflenen genle eşlenir. Genomik DNA’nın hücre popülasyonundan izole edilmesiyle, ilgi fenotipine neden olan genler, sgRNA b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Genom Kanada, Ontario Araştırma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (MOP-142375, PJT-148802) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
Referências
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
- Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
