精子は、卵母細胞を受精させるために卵管を正常にナビゲートしなければならない。ここでは、 elegansふたなり子宮内での精子移動を測定するためのアッセイについて説明する。このアッセイは、交配後の子宮内の精子分布、ならびに速度、方向速度、および反転周波数に関する定量的データを提供することができます。
成功した受精は生殖の基本であるが、女性の生殖管の中で精子を卵母細胞に導くメカニズムについてはほとんど知られていない。体外研究では、内部で受精する動物の精子が周囲からの様々な合図に反応できることを示唆しているが、女性生殖器内の行動を視覚化することができないことは、精子の移行を理解するための挑戦を作成するとそのネイティブ環境でのモビリティ。ここでは、この制限を克服し、その透明な表皮を利用するc. elegansを用いた方法について述べる。ミトコンドリア色素で染色されたelegansの雄は、修飾雌として作用する成体 hermaphrodites と交配し、蛍光標識精子をふたなり子宮に堆積する。標識された精子の遊走および運動性は、ライブふたなりにおける epi 蛍光顕微鏡を使用して直接追跡することができます。野生型動物では、標識された精子の約 90% が子宮を通ってクロールし、受精部位に到達するか、または spermatheca する。子宮の画像は、子宮内の精子の分布および spermatheca に達した精子の割合を評価するために交配後1時間摂取することができる。あるいは、時間経過画像は、精子速度、方向速度および逆転頻度を評価するために交配直後に撮影することができる。この方法は、 elegansのために利用可能な他の遺伝的および分子ツールと組み合わせて、女性の生殖管内の精子の誘導および運動性を調節するのに重要な新規の遺伝的および分子的メカニズムを同定することができる。
精液 (精子と呼ばれる) が卵母細胞に向かって女性の生殖管を通って移動する分子機構はよく理解されておらず、性的生殖の基本である。精子の運動性は非常にダイナミックであり、精子の速度と方向の運動性を変更する堅牢な通信信号に依存します1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. c. elegansはふたなりの透明な表皮が単一の細胞の決断2,3で生きている精子の追跡を可能にするので、インビボで精子の動きを研究するための力強いモデルになった 8、10。本論文の目的は、 elegansふたなり子宮内の精子の動きを評価するための方法を提供することである。
精子と卵子が外部環境 (すなわち水草環境) で出会う動物種では、精子は卵母細胞によって分泌される走化性シグナルに反応する。これらの信号は、精子の動きの方向を導き、それらを信号源4、6、11に近づける。しかし、内部で受精する種における精子の動きについては、はるかに少ないことが知られている。主な課題は、ほとんどの種の顕微鏡検査にアクセスできない女性の生殖路のアーキテクチャです。ヒトにおけるインビトロ研究では、マウス、およびブタは、例えば、精子の亜集団が chemoattractants、流体の流れ、および熱勾配1、5、7、9に応答することができるという証拠を提供し、 12です。これらのシステムによって、インビボでの精子の動きを視覚化および追跡することができないことは、これらの機能を調節する主要なメカニズムを発見するための戦略に重大な制限を置く。
これらの制限を克服するために、線虫c. elegansを用いて受精後の精子を直接可視化し、インビボで個々の精子移行パラメータを測定し、そして精子集団の能力を目標に測定する方法を開発しました。受精部位。これらの方法は、 elegans分子および遺伝的ツールセットと共に、精子運動性挙動を調節する化学シグナル分子および分子機械の発見を容易にする。例えば、遺伝スクリーンは、インビボ13における効率的な精子運動に必須である遺伝子を同定するために hermaphrodites または雄で実施することができる。分子をふたなり生殖腺に注入して、精子の活性化、遊走速度、方向運動性3に対する効果をテストすることができます。さらに、記述された方法は、異所性の身体位置への不正な精子の移行を監視し、精子競争10、14を評価するために使用することができる。
C. elegansは、hermaphrodites と雄のように自然界に存在する (図 1参照)。ふたなり生殖腺には、互いの鏡像である2つの U 字形のアームがあります。L4 幼虫期には、最も近位の生殖細胞 (すなわち、spermatheca 近傍の細胞) が精子形成を受ける。各プライマリ spermatocyte は減数分裂に入り、4つの半数 spermatids を生成します。これらの spermatids は、最初の成熟した卵母細胞と共に spermatheca に押し込まれ、spermiogenesis15を受ける。精子形成から oogenesis への成人 hermaphrodites スイッチ。卵母細胞は、生殖腺に沿って組み立てラインの方法で成熟し、最も成熟した卵子は生殖腺の近位端で、spermatheca の隣にあります。精子からの MSP 信号は、meiotic 成熟および排卵16,17を誘発するために必要とされる。一方、オスc. elegansは、精子のみを生産する J 字型の生殖腺を持っています。Spermatids は、精嚢に保存されている。ふたなりやメスと交配すると、オスは尾の近くの spicules を外陰部に挿入します。Spermatids は、射精中に活性化され、彼らは精液流体18と接触するとき。Elegans精子は flagellated ではないので、泳いではいけません。代わりに、彼らは運動のための pseudopod を使用して、生殖管を介してクロールします。それは十分にサイズが大きい男性の精子がふたなり精子14上の競争上の利点を持っていることが確立されています。
この方法では、雄c. elegansは精子ドナーとして作用し、成人 hermaprhodites と交配される。成人男性は蛍光性ミトコンドリア色素で染色され、標識精子が生成される。いったんふたなり外陰部を通して沈着した精子は、子宮内の胚を spermatheca、または受精部位に向けて這う必要がある。Elegansモデルの透明な表皮は、女性の生殖路を通って移動するので、個々の精子を直接可視化することができます。近年では、私たちの研究室では、F シリーズプロスタグランジンのクラスは外陰部から spermatheca19,20に精子を導くことの重要性を実証するために、この方法を首尾よく使用しています。精子によるふたなりと応答によってその合成を支配する分子 mechansims は、まだ調査中である。しかし、精子の運動性および遊走を評価するこの方法は、内部で受精動物に精子や卵母細胞の通信を制御するキープレーヤーの同定を容易にする。以下のプロトコルは、このアッセイを実行する方法を段階的に説明する。
複雑な女性の生殖路をナビゲートし、卵母細胞を見つけるために精子の能力は、性的生殖のために重要です。内部で施肥された動物の精子を用いた最近の研究では、化学物質のシグナル、流体の流れ、温度の勾配など、さまざまな環境の手掛かりに積極的に反応することを示唆しています1、5、7、9,しかし、これらの観察は、大部分はインビトロ実験に起因しており、生殖管内の精子の挙動およびコミュニケーションについてはほとんど知られていない。精子の移行と運動におけるインビボデータを取得するための主な障壁の1つは、ほとんどの女性の生殖路内の可視性の欠如である。Elegansを使用してここで説明した方法は、この制限を克服します。代表結果が示すように、透明な表皮は生きた、無傷の生物の単一の細胞の決断で各精子の直接視覚化そして追跡を可能にする。
C. elegansは、2つの男女を持っています。男性は、XO 遺伝子型で、精子のみを産生し、そしてこの方法では、精子ドナーとして使用される。ふたなりは、XX 遺伝子型で、女性を変更します。彼らの生殖腺は、第4幼虫期の間に精子形成を受け、成人期25で oogenesis に切り替えます。このアッセイは、生殖組織が女性の生殖管のモデルを提供する成人 hermaphrodites を使用します。このアッセイにおいて男女の両方を利用することにより、精子の誘導と運動性を調節する可能性のある男性と女性の両方の遺伝的および分子的経路を同定することができます。Elegansのために利用可能な遺伝的および分子的技術の全ホストと組み合わせることで、この方法は、精子の遊走および運動性だけでなく、精子および卵母細胞の通信に新しい洞察をもたらす可能性があります。
このプロトコルのいくつかの重要なステップは、プロトコルセクションで提供される詳細に加えて、さらなる考慮を保証します。
ワーム
fog-2 (q71)、彼-5 (e1490)、または彼-8 (e1489)変異体雄は、N2 男性の代わりに使用することができる。これらの変異は、培養中の男性の頻度を増加させるが、男性の交配または精子機能13には影響を与えない。女性は、例えば霧-2 (q71)メス、hermaphrodites の代わりに使用することができる。しかし、適切な卵母細胞の発達を可能にするために、雌は雄と事前に交配されなければならない。この前交配からの受精胚の存在はまた、子宮が適切に精子分布を評価するのに十分な長さであることを保証する。変異型または実験的 hermaphrodites が評価されている場合は、対照群 (複数可) を含む。例えば、変異 hermaphrodites は、アッセイにおける他の変数に対する対照として野生型 N2 hermaphrodites と対にするべきである。RNA 干渉アッセイのためにプラスミドを含む細菌を摂食された Hermaphrodites は、空のベクターコントロールを含むバクテリアも供給する必要があります。外陰部からの距離は、精子が授精するところで、spermatheca に対して、受精部位に、子宮内の卵の数に応じて変化させることができる (すなわち、子宮は、卵数の増加に伴って膨張する)。遺伝子型間の比較を行う場合は、頚に類似する数の卵が含まれている hermaphrodites を選択します。孵化胚または幼虫の移動を含む hermaphrodites は選択しないでください。Hermaphrodites をアッセイすべき最適な年齢を特定するために、タイムコースを実施することができる。
ピッキング hermaphrodites と男性
このアッセイのために選ばれた hermaphrodites は、生い茂ったまたは飢えたプレートからではないことが重要です。食品とフェロモンのキューは、DAF-7、TGFßホモログの表現を調節します。DAF −7経路は、spermatheca20に精子を導く上で重要な役割を果たしている F シリーズプロスタグランジンの合成を調節することが示されている。過密または飢餓のプレートから hermaphrodites を選ぶと、目的のターゲットに関連しない貧しい精子の指導をもたらす可能性があります。プレートの密度は、男性の精子に影響を与えるようには見えません。しかし、あまりにも若すぎるか、または古すぎる男性は、嵌合効率を低下させることがある (すなわち、それらの頚に十分な精子を有する嵌合プレート上の hermaphrodites の割合を定量化する)。1-3 日齢成人男性は、このアッセイ23に最適である。
麻酔 hermaphrodites
私たちの手の中で、Tetramisole と Tricaine の組み合わせは、ワームが固定化され、交配と画像取得中に生き続けることを保証します。アジ化ナトリウムなどの他の麻酔薬も使用できます。しかし、アジ化ナトリウムは非常に有毒であり、条件を標準化する必要があります。マイクロビーズ、アガロース、およびマイクロ流体チャンバを使用する固定化技術は、交配を妨害するので推奨されません。
男性染色
本稿で使用されている水戸染料は、MitoTrackerCMXRos、 elegansにおいて、精子やその他のミトコンドリアを標識するために広く用いられてきた。この水戸染料で標識された精子は、完全に機能し、活性化される能力を保持し、移行し、卵子を受精し、そして生存可能な子孫26、27を産生する。ローダミン6g および DiOC6 などの他のミトコンドリア染料は、 elegansミトコンドリア28,29に染色するために使用されてきた。しかしながら、これらの染料のための条件は、このアッセイにおいて精子を標識するために標準化される必要がある。Mitochrondrial 標識機構に加えて、Syto17 のような DNA 染色剤も、遊走アッセイ30のために精子にラベルを付けるために使用されてもよい。これらの標識技術は比較的容易かつ迅速に行うことができるが、トランスジェニック戦略は、精子特異的プロモーター31,32の下で蛍光タグを発現する精子を生成するために用いられてもよい。
交配
厚すぎる嵌合ドットは、嵌合効率が低下する可能性があります。男性を移送し、hermaphrodites に麻酔をかけたときは、できるだけ少ないバクテリアを移送するように注意する必要があります。
アガロースパッドの作成とカバースリップの配置
気泡は、アガロースパッド内に生成することができます。それらは、画像取得中に光を屈折させるか、または、十分に大きい場合には、ワームが通過する原因となり、画像を取得することを不可能にする。同様に、アガロースパッド上にカバースリップが配置されると、hermaphrodites に沿って気泡が生成されることがあります。これらの気泡は光を屈折させると画質低下につながります。練習は、気泡の発生を減少させるのに役立ちます。
定量化
精子の分布を定量化するとき、ワームの子宮を通る異なる z 面は、精子分布にわずかな違いがあるかもしれません。Spermatheca に焦点を当てた単一の画像を撮ると、複数の z セクションを平均した結果に似た再現性のある結果が得られることがわかります。Spermatheca の中心に画像を焦点を合わせることをお勧めしますが、焦点面は実験者のニーズに基づいてわずかに変更することができます。ただし、すべてのイメージが同じ方法で取得されることが重要です。さらに、集中している精子だけがカウントされることが重要である。インフォーカス精子の基準を決定する際のカウンターの裁量です。ただし、定量化されるすべてのワームに対して、基準が体系的に適用されることが重要です。精子の追跡のために、多くのソフトウェアは、自動追跡機能を提供します。しかし、次の2つの主な理由から、手動追跡はソフトウェアの自動追跡アルゴリズムよりも優れていることがわかります。 1) 限られた空間内で同様の大きさの核が存在すると、ソフトウェアが個々の精子を区別することが困難になる各精子に対して定義された ROIs を作成します。2) 精子が焦点から入ったり出たりすると、強度が変化し、ソフトウェアが長期間にわたって精子を追跡することが困難になります。
The authors have nothing to disclose.
精子と卵母コミュニケーションをよりよく理解するためのツールとして、この方法のインスピレーションと無私の指導と創造のために、私たちの亡きメンター、マイケル・ミラー博士に心から感謝します。彼の突然の通過は、彼の家族、彼の研究室、そして科学界にとって大きな損失となっています。この研究は、NIH によってサポートされました (R01GM085105 に MAM と F30HD094446 に MH).コンテンツは、著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Reagents and Material | |||
60mm x 15mm Petri Dish | Fisher | FB0875713A | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
LB broth, Miller | Fisher | 1426-2 | |
Escherichia coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC |
N2 | CGC | N2 | |
fog-2(q71) | CGC | CB4108 | |
Platinum wire 0.25mm dia | Alfa Aesar | 10288 | |
5 3/4" Disposable Pasteur pipet | Fisher | 13-678-20A | |
Watch glass | Fisher | 02-612A | |
5mm Dia. Glass rod | Fisher | 50-121-5269 | |
MitoTracker CMXRos (Mito-dye) | Fisher | M7512 | Shield from light, store at -20°C |
Monopostassium phosphate | Fisher | P285-500 | |
Disodium phosphate | Fisher | S374-1 | |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-1 | DMSO |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-102 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma | E10521-10G | Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20°C. |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G | Store in aliquotes at -20°C |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Coverslips | Fisher | 12-548-A | 18 x 18-1 |
Frosted microscope slides | Fisher | 12-552-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
16°C and 20°C incubators | Fisher | 97-990E | Same model, set at different temperatures. |
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives | Nikon | ||
Software with image acquisition and tracking capabilities | Nikon | NIS-elements AR | |
Stereo-microscope | Nikon | SMZ800N | Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol |