唾液圏または単層としての体外増殖のためのヒト唾液腺からの唾液上皮細胞の単離

Summary

一次ヒト唾液腺由来上皮細胞を分離・培養する方法を提示する.これらの細胞は唾液上皮起源の遺伝子発現パターンを示し、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム腫瘍細胞に由来する基塩膜マトリックス上の唾液圏として、または処理された培養皿上の単層として増殖することができる。

Abstract

唾液腺は、人間の病気の複数の側面に興味を持つ研究者のための重要な関心のサイトです。研究者の1つの目標は、放射線療法によって損傷を受けた腺の機能を回復するか、シェーグレン症候群に関連する病理に起因する。研究者の第二の目標は、ウイルスが腺組織内で複製するメカニズムを定義し、水平伝播に重要な唾液液にアクセスできることです。これらの目標は、上記に興味を持つ研究者だけでなく、関連する研究分野で利用することができる体外唾液腺モデルの堅牢でアクセス可能な必要性を強調しています。ここでは、ヒト唾液腺から上皮細胞を分離し、インビトロで伝播する簡単なプロトコルについて説明します。私たちのプロトコルは、個々の研究のニーズを満たすためにさらに最適化することができます。簡単に言えば、唾液組織は機械的および酵素的に分離され、単一細胞または細胞の小さなクラスターを単離する。上皮細胞の選択は、上皮細胞増殖を促進するために最適化された培地膜マトリックス上にめっきすることによって起こる。これらの得られた培養物は、「唾液圏」と呼ばれる三次元クラスターとして維持することも、処理されたプラスチック組織培養皿上の単層として成長させることができる。このプロトコルは、細胞老化を受け入れる前に5-8の通路(15〜20集団倍増)のために伝播することができる主に上皮細胞の異種集団の成長をもたらす。

Introduction

哺乳類では、唾液腺は、耳下腺、顎下腺、および言語下腺の3組の主要な唾液腺に編成される。また、舌の上に位置し、口腔1全体に散在する一連のマイナー腺が存在する。主要な腺は、2を生成した唾液のバルク量を担当しています.分泌因子を介して抗菌保護を提供することに加えて、唾液は食^道2を通過する食品を噛み、潤滑する過程で重要である。したがって、唾液腺機能不全は、十分な唾液を産生することができない患者が、歯科空洞や口腔カンジダ症3などの病気を発症しやすい医学的問題を表す。さらに、唾液の減少は、生活の質に大きな影響を与える食べ物を食べたり消化するのが難しくなります。

唾液腺機能不全は、主にシェーグレン症候群、自己免疫疾患、または照射療法を受けた頭頸部癌患者3,4,5に罹患している患者に見られる。 ⁶.自己免疫または放射線療法の結果として腺内の損傷した分泌性アチーニは自己更新を受けず、不可逆的な損傷を受けた患者を生きる6.唾液腺の研究はまた、ウイルス病因のメカニズムに興味を持つ注目や研究者を集めています。ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のような一部の病原体は、唾液腺内で持続的に複製し、唾液7、8を介して新しい宿主に新しい宿主に新しい宿主に伝染することを可能にする。したがって、唾液腺組織の堅牢で再現性の高いモデルを開発し、多様な医学的問題に取り組み、理解する必要があります。

マウス唾液腺系のいくつかのモデルは、唾液腺9、10を形成する異なる上皮細胞を理解し、特徴付ける出発点として使用されている。ヒトとマウスの唾液^腺11の間には明らかな大きな違いがある。最も顕著なヒト耳下腺は、下顎腺に関連して大きいのに対し、マウスの顎下腺および耳下腺は、サイズ1、2、11でかなり類似している。不死化ヒトのマンディビバル細胞株は存在するが、不死化細胞が原発組織の表現型を正確に維持しておらず、不死化細胞が実際に由来していないという二次的懸念が大きな懸念がある。唾液上皮自体¹².これらの理由から、ヒトから一次唾液組織を研究する興味と必要性があります。

ここでは、組織培養のためのヒト唾液腺から原発上皮細胞を分離するプロトコルについて説明する。私たちのプロトコルは、一般的に彼らの手順を簡素化するために行われた変更を加えたPringle et al. と Tran らの作品に基づいています^13,14.まず、Tran et al.のプロトコルは唾液組織を酵素的に消化するための長い5時間のインキュベーションを必要としますが、私たちの改変されたプロトコルは、プリングルらと同様に、わずか1時間のインキュベーションで成功しています。第二に、我々は組織消化のために異なる酵素を使用し、最も顕著なのは、元のTranらプロトコルで使用されているようにトリプシンを使用せず、代わりにジスパーゼとコラゲナーゼの混合物を使用します。我々は、最近の研究がトリプシンによる唾液組織の初期消化が細胞生存率の低下をもたらすことを示唆したように、初期消化ステップでトリプシンを避けることを好む、おそらくまれな幹細胞^集団15の喪失によって。最後に、気管支上皮細胞の伝播のために処方された市販の培地を用いて、基塩膜マトリックス(BMM)の表面に唾液を培養する。私たちのプロトコルは、唾液細胞を耳下腺、顎下腺、および言語下腺から単離するために使用することができます。これらの細胞は唾液アミラーゼおよび他の唾液特異的遺伝子を発現し、唾液アシナー上皮細胞7と同様の表現型を維持することを示す。この方法論を用いて、>50の一次ヒト組織サンプルから唾液培養物を生成することに成功しました。さらに、一次唾液細胞は、後日使用するために容易に凍結保存することができる。

Protocol

これらのプロトコルと研究は、シンシナティ大学の機関審査委員会(連邦全体保証#00003152、IRBプロトコル2016-4183)によってレビューされ、承認されています。唾液組織は、一般的に多くの頭頸部外科的処置で切除され、通常、悪性プロセスによって関与しない。典型的には、新たに切除された唾液腺組織は、患者から除去した後2〜4時間以内に使用される(図1A)。 <p class=…

Representative Results

消化された組織からBMMに細胞をめっきしてから2~3日後、細胞はクラスター当たり最大15~20個の細胞の大きさで膨張し続ける小さなクラスターを容易に形成する(図2A)。細胞の破片や剥離した死細胞は一般的に見られ、新鮮な媒体を吸引し、補充することによって除去されるべきです。細胞は、約3〜10日間、またはBMM層がそのまま残っている限り、?…

Discussion

唾液機能不全は、シェーグレン症候群に罹患している人々の生活の質に対する懸念を表し、唾液腺3、4、5^に隣接する癌に対する放射線治療を受けている人々の生活の質に関する懸念を表します。 ¹⁶.これらの患者を治療するための1つの提案された治療法は、インビトロで機能性唾液幹細胞または?…

Materials

100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI