En raison du chevauchement spectral des longueurs d’onde d’excitation et d’émission des analogues NADH et fura-2, l’interférence du signal des deux produits chimiques dans les cellules vivantes est inévitable lors de la mesure quantitative de [Ca2′]. Ainsi, une nouvelle méthode de correction en ligne de l’interférence du signal NADH pour mesurer [Ca2]a été développée.
Pour mesurer [Ca2′] quantitativement, les analogues fura-2, qui sont des fluoroprobes ratiométriques, sont fréquemment utilisés. Cependant, l’utilisation de colorant est intrinsèquement limitée dans les cellules vivantes en raison de l’interférence d’autofluorescence, principalement du dinucleotide d’adénine de nicotinamide (NADH). Plus précisément, il s’agit d’un obstacle majeur lors de la mesure de la mitochondriale [Ca2 ]quantitativement en utilisant des analogues fura-2 parce que la majorité de NADH est dans les mitochondries. Si la concentration de colorant fluorescent est la même, une certaine intensité d’excitation devrait produire la même intensité d’émission. Par conséquent, le rapport d’intensité des émissions de deux longueurs d’onde d’excitation différentes devrait être constant. Sur la base de ce principe, une nouvelle méthode de correction en ligne de l’interférence de signal NADH pour mesurer [Ca2]a été développée, et l’intensité réelle de signal de NADH et fura-2 peut être obtenue. En outre, une nouvelle équation à calculer [Ca2]a été développée avec une excitation ou une excitation isosbestique à 400 nm. Avec cette méthode, les changements dans les mitochondries [Ca2]pourraient être mesurés avec succès. En outre, avec un ensemble différent des longueurs d’onde d’excitation et d’émission, plusieurs paramètres, y compris NADH, [Ca2],et le pH ou le potentiel de membrane mitochondriale(M),pourraient être mesurés simultanément. Les mitochondries [Ca2m]etm ou pH ont été mesurées à l’aide de fura-2-FF et de téramethylrhodamine ester éthylin (TMRE) ou carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1).
Le rôle significatif de ca2 intracellulaire est largement connu1. La quantification de [Ca2′] est essentielle pour comprendre les processus des fonctions physiologiques cellulaires. Les analogues Fura-2 sont très utiles parce qu’ils sont excités dans la gamme UV (400 nm), et la méthode ratiométrique peut être appliquée pour la mesure quantitative. Par conséquent, d’autres paramètres physiologiques tels que le pH, le potentiel membranaire, etc., peuvent être mesurés avec d’autres colorants fluorescents. La concentration mitochondriale de Ca2 ‘([Ca 2‘]m)aurait été de 0,08 à 20 m2,3,4,5. Parmi les analogues fura-2, fura-2-FF est approprié pour mesurer cette gamme de [Ca2]. Cependant, les cellules vivantes contiennent malheureusement NADH/NADPH pour leurs processus métaboliques, et NADH génère l’interférence de signal en raison du chevauchement des spectres d’excitation et d’émission avec l’analogique fura-2. Cette interférence limite considérablement l’utilisation des analogues fura-2. Plus précisément, si l’analogique est appliqué pour mesurer les mitochondries [Ca2],cette interférence est le plus grand obstacle parce que la plus grande quantité de NADH est dans les mitochondries. Ceci est encore compliqué par les changements NADH étant liés au potentiel de membrane mitochondriale(m) et le changement de‘m affecte [Ca2 ‘]m6,7,8 , 9. En outre, pour étudier la dynamique [Ca2]m, il est essentiel de connaître l’état d’autres paramètres mitochondriaux, tels que nADH,m, et pH.
Les émissions à 450 nm et 500 nm avec des excitations à 353 nm, 361 nm, et 400 nm contiennent les signaux de NADH et fura-2-FF, et les équations sont les suivantes. Ici, 353 nm et 361 nm sont les points isosbestic de fura-2-FF pour les émissions à 450 nm et à 500 nm, respectivement.
F361 450 ‘ F361 450,NADH ‘ F361 450,Fura Equation 1
F353 500 ‘ F353 500,NADH ‘ F353 500,Fura Equation 2
F400 500 et F400 500,NADH et F400 500,Fura Equation 3
où Fx,y est l’intensité d’émission mesurée à y-nm par x-nm excitation, Fx,y,NADH représente l’intensité pure d’émission NADH-dépendante, et Fx,y,Fura représente l’intensité pure d’émission fura-2-FF-dépendante. Sous la même concentration du colorant fluorescent, une certaine intensité d’excitation devrait produire la même intensité d’émission. Par conséquent, le rapport d’intensité des émissions de deux longueurs d’onde d’excitation différentes devrait être constant. Ca2 et fura-2 n’ont pas affecté les caractéristiques de fluorescence du NADH; par conséquent, le rapport de l’émission à 450 nm et à 500 nm de NADH était constant à n’importe quelle longueur d’onde d’excitation. La même règle peut être utilisée pour le fura-2-FF en partant de l’hypothèse que le NADH ou [Ca2]n’affecte pas les spectres d’émission et d’excitation de fura-2-FF. Cependant, Ca2 a causé un changement spectral de l’émission de fura-2-FF. Par conséquent, pour supprimer l’effet de Ca2, excitation isosbestique, qui est indépendant de Ca2, doit être utilisé. Chaque longueur d’onde d’émission (c.-à-d., 450 nm et 500 nm) a un point isosbestic différent, et de notre configuration expérimentale, 353 nm à 500 nm et 361 nm à 450 nm ont été choisis. De ceux-ci, les équations suivantes sont valides10.
Rf f F361 450,Fura/F353 500,Fura Equation 4
RN1 – F400,500,NADH/F361 450,NADH Equation 5
RN2 – F353,500,NADH/F361 450,NADH Equation 6
Avec ces constantes, les équations suivantes de (Equation 1) (Equation 2) et (Equation 3) sont valides.
F361 450 ‘ F361 450,NADH ‘ Rf ‘ F353 500,Fura Equation 7
F353 450 ‘ RN2 ‘F361,450,NADH ‘ F353,500,Fura Equation 8
F400,500 ‘ RN1 ‘F361,450,NADH ‘F400,500,Fura Equation 9
De ces équations, si Rf, RN1, et RN2 sont connus, des signaux purs de NADH et fura-2 peuvent être obtenus comme suit.
F361 450,NADH (F361 450 – Rf – F353 500)/(1 ‘ Rf ‘ RN2) Équation 10
F353 500,Fura (RN2 – F361 450 – F353 500)/(Rf ‘ RN2 ‘ 1) Équation 11
F400,500,Fura ‘ F400,500 ‘ RN1 ‘ F361,450,NADH Équation 12
RFura – F353 500,Fura/F400 500,Fura Equation 13
La forme Ca2-bound de fura-2-FF était pratiquement non-fluorescent à la longueur d’onde d’excitation de 400 nm. Sur la base de cette propriété, la nouvelle équation d’étalonnage suivante peut être dérivée.
[Ca2 ‘] ‘ Kd ‘ (F400,500,max/F353,500,max) ‘(RFura ‘ Rmin) Équation 14
où Kd est une constante de dissociation, F400,500,max et F353,500,max sont les valeurs maximales des signaux émis à 500 nm avec des excitations à 400 nm et 353 nm, respectivement, et Rmin est le minimum RFura en Ca2 –-condition libre. Puisque les excitations isosbestic ont été utilisées, l’équation peut être simplifiée plus loin comme suit.
[Ca2 ‘] ‘ Kd ‘ (1 / Rmin) ‘ (RFura ‘ Rmin) Équation 15
Par conséquent, seules les valeurs Kd et Rmin sont nécessaires pour calculer [Ca2′].
La méthode de correction des interférences a été développée avec succès pour mesurer les signaux des analogues NADH et fura-2. La mesure exacte des signaux est essentielle pour la correction exacte. Cependant, la nature inhérente de l’appareil fluorescent produit un signal de fond sans rapport avec celui de NADH de fura-2. Le filtre de bande-passe de la plus haute qualité ne peut passer que jusqu’à 10à 8 des longueurs d’onde indésirables de la lumière. Cependant, le signal fluorescent d’une seule …
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été partiellement soutenu par le Programme de recherche en sciences fondamentales par l’intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financé par le Ministère de l’éducation (2018R1A6A3A01011832), par le Ministère des sciences, des TIC et de la Planification de l’avenir (NRF-2016M3C1A6936606) et par le Ministère du commerce, de l’industrie et de l’énergie (10068076).
2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
Green tube | DWM | test tube | |
HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |