Une nouvelle nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Méthode pour la mesure intracellulaire Ca2 avec Fura-2-Analog dans les cellules vivantes

Summary

En raison du chevauchement spectral des longueurs d’onde d’excitation et d’émission des analogues NADH et fura-2, l’interférence du signal des deux produits chimiques dans les cellules vivantes est inévitable lors de la mesure quantitative de [Ca^2′]. Ainsi, une nouvelle méthode de correction en ligne de l’interférence du signal NADH pour mesurer [Ca^2]a été développée.

Abstract

Pour mesurer [Ca^2′] quantitativement, les analogues fura-2, qui sont des fluoroprobes ratiométriques, sont fréquemment utilisés. Cependant, l’utilisation de colorant est intrinsèquement limitée dans les cellules vivantes en raison de l’interférence d’autofluorescence, principalement du dinucleotide d’adénine de nicotinamide (NADH). Plus précisément, il s’agit d’un obstacle majeur lors de la mesure de la mitochondriale [Ca^{2 ]}quantitativement en utilisant des analogues fura-2 parce que la majorité de NADH est dans les mitochondries. Si la concentration de colorant fluorescent est la même, une certaine intensité d’excitation devrait produire la même intensité d’émission. Par conséquent, le rapport d’intensité des émissions de deux longueurs d’onde d’excitation différentes devrait être constant. Sur la base de ce principe, une nouvelle méthode de correction en ligne de l’interférence de signal NADH pour mesurer [Ca^2]a été développée, et l’intensité réelle de signal de NADH et fura-2 peut être obtenue. En outre, une nouvelle équation à calculer [Ca^2]a été développée avec une excitation ou une excitation isosbestique à 400 nm. Avec cette méthode, les changements dans les mitochondries [Ca^2]pourraient être mesurés avec succès. En outre, avec un ensemble différent des longueurs d’onde d’excitation et d’émission, plusieurs paramètres, y compris NADH, [Ca^2],et le pH ou le potentiel de membrane mitochondriale_(M),pourraient être mesurés simultanément. Les mitochondries [Ca^2m]et_m ou pH ont été mesurées à l’aide de fura-2-FF et de téramethylrhodamine ester éthylin (TMRE) ou carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1).

Introduction

Le rôle significatif de ca^{2 intracellulaire} est largement connu¹. La quantification de [Ca^2′] est essentielle pour comprendre les processus des fonctions physiologiques cellulaires. Les analogues Fura-2 sont très utiles parce qu’ils sont excités dans la gamme UV (400 nm), et la méthode ratiométrique peut être appliquée pour la mesure quantitative. Par conséquent, d’autres paramètres physiologiques tels que le pH, le potentiel membranaire, etc., peuvent être mesurés avec d’autres colorants fluorescents. La concentration mitochondriale de Ca^{2 ‘([Ca} 2^‘]_m)aurait été de 0,08 à 20 m^2,3,4,5. Parmi les analogues fura-2, fura-2-FF est approprié pour mesurer cette gamme de [Ca^2]. Cependant, les cellules vivantes contiennent malheureusement NADH/NADPH pour leurs processus métaboliques, et NADH génère l’interférence de signal en raison du chevauchement des spectres d’excitation et d’émission avec l’analogique fura-2. Cette interférence limite considérablement l’utilisation des analogues fura-2. Plus précisément, si l’analogique est appliqué pour mesurer les mitochondries [Ca^2],cette interférence est le plus grand obstacle parce que la plus grande quantité de NADH est dans les mitochondries. Ceci est encore compliqué par les changements NADH étant liés au potentiel de membrane mitochondriale_(m) et le changement de_‘m affecte [Ca^{2 ‘}]_m^{6,7,8 , 9}. En outre, pour étudier la dynamique [Ca^2]_m, il est essentiel de connaître l’état d’autres paramètres mitochondriaux, tels que nADH,_m, et pH.

Les émissions à 450 nm et 500 nm avec des excitations à 353 nm, 361 nm, et 400 nm contiennent les signaux de NADH et fura-2-FF, et les équations sont les suivantes. Ici, 353 nm et 361 nm sont les points isosbestic de fura-2-FF pour les émissions à 450 nm et à 500 nm, respectivement.

F_{361 450} ‘ F_{361 450,NADH} ‘ F_{361 450,Fura} Equation 1
F_{353 500} ‘ F_{353 500,NADH} ‘ F_{353 500,Fura} Equation 2
F_{400 500} et F_{400 500,NADH} et F_{400 500,Fura} Equation 3

où F_x,y est l’intensité d’émission mesurée à y-nm par x-nm excitation, F_x,y,NADH représente l’intensité pure d’émission NADH-dépendante, et F_x,y,Fura représente l’intensité pure d’émission fura-2-FF-dépendante. Sous la même concentration du colorant fluorescent, une certaine intensité d’excitation devrait produire la même intensité d’émission. Par conséquent, le rapport d’intensité des émissions de deux longueurs d’onde d’excitation différentes devrait être constant. Ca^{2 et} fura-2 n’ont pas affecté les caractéristiques de fluorescence du NADH; par conséquent, le rapport de l’émission à 450 nm et à 500 nm de NADH était constant à n’importe quelle longueur d’onde d’excitation. La même règle peut être utilisée pour le fura-2-FF en partant de l’hypothèse que le NADH ou [Ca^2]n’affecte pas les spectres d’émission et d’excitation de fura-2-FF. Cependant, Ca^{2 a} causé un changement spectral de l’émission de fura-2-FF. Par conséquent, pour supprimer l’effet de Ca², excitation isosbestique, qui est indépendant de Ca², doit être utilisé. Chaque longueur d’onde d’émission (c.-à-d., 450 nm et 500 nm) a un point isosbestic différent, et de notre configuration expérimentale, 353 nm à 500 nm et 361 nm à 450 nm ont été choisis. De ceux-ci, les équations suivantes sont valides¹⁰.

R_f f F_{361 450,Fura}/F_{353 500,Fura} Equation 4
R_N1 – F_400,500,NADH/F_{361 450,NADH} Equation 5
R_N2 – F_353,500,NADH/F_{361 450,NADH} Equation 6

Avec ces constantes, les équations suivantes de (Equation 1) (Equation 2) et (Equation 3) sont valides.

F_{361 450} ‘ F_{361 450,NADH} ‘ R_f ‘ F_{353 500,Fura} Equation 7
F_{353 450} ‘ R_N2 ‘F_361,450,NADH ‘ F_353,500,Fura Equation 8
F_400,500 ‘ R_N1 ‘F_361,450,NADH ‘F_400,500,Fura Equation 9

De ces équations, si R_f, R_N1, et R_N2 sont connus, des signaux purs de NADH et fura-2 peuvent être obtenus comme suit.

F_{361 450,NADH} (F_{361 450} – R_f – F_{353 500})/(1 ‘ R_f ‘ R_N2) Équation 10
F_{353 500,Fura} (R_N2 – F_{361 450} – F_{353 500})/(R_f ‘ R_N2 ‘ 1) Équation 11
F_400,500,Fura ‘ F_400,500 ‘ R_N1 ‘ F_361,450,NADH Équation 12
R_Fura – F_{353 500,Fura}/F_{400 500,Fura} Equation 13

La forme Ca²-bound de fura-2-FF était pratiquement non-fluorescent à la longueur d’onde d’excitation de 400 nm. Sur la base de cette propriété, la nouvelle équation d’étalonnage suivante peut être dérivée.

[Ca^{2 ‘}] ‘ K_d ‘ (F_400,500,max/F_353,500,max) ‘(R_Fura ‘ R_min) Équation 14

où K_d est une constante de dissociation, F_400,500,max et F_353,500,max sont les valeurs maximales des signaux émis à 500 nm avec des excitations à 400 nm et 353 nm, respectivement, et R_min est le minimum R_Fura en Ca^{2 –}-condition libre. Puisque les excitations isosbestic ont été utilisées, l’équation peut être simplifiée plus loin comme suit.

[Ca^{2 ‘}] ‘ K_d ‘ (1 / R_min) ‘ (R_Fura ‘ R_min) Équation 15

Par conséquent, seules les valeurs K_d et R_min sont nécessaires pour calculer [Ca^2′].

Protocol

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité local de soins et d’utilisation des animaux en établissement. 1. Préparation de la solution Préparer des myocytes cardiaques isolés simples11.REMARQUE : Chaque laboratoire peut avoir une solution de stockage cellulaire différente. Ici, les myocytes sont stockés dans le milieu de culture (DMEM). Préparer 100 ml de ca2- solution gratuite (tableau 1</str…

Representative Results

Changements mitochondriaux Ca2mD dus à la correction10La figure 4 montre les changements dans [Ca2 ‘] m avant et après la correction. Les résultats ont clairement montré les changements substantiels dans [Ca2 ‘m. La concentration mitochondriale de calcium au repos sans cytosolique Ca2 ‘ ([Ca2 ‘]c) était de 1,03 à 0,13 M (moyenne , S.E., n ‘ 32), et le maximum [Ca2 ‘]m<…

Discussion

La méthode de correction des interférences a été développée avec succès pour mesurer les signaux des analogues NADH et fura-2. La mesure exacte des signaux est essentielle pour la correction exacte. Cependant, la nature inhérente de l’appareil fluorescent produit un signal de fond sans rapport avec celui de NADH de fura-2. Le filtre de bande-passe de la plus haute qualité ne peut passer que jusqu’à 10^{à 8} des longueurs d’onde indésirables de la lumière. Cependant, le signal fluorescent d’une seule …

Materials

2 mL eppendorf tube	Axygen	MCT-200-C	2 mL Tube
AD/DA converter	Instrutech	ITC-18	Equipment
ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma-aldrich	A5285	Chemicals
Band pass filter	Ealing Electro-Optics, Inc	35-3920	Equipment, 640±11nm
Band pass filter	Omega Optical	690-9823	Equipment, 590±15nm
Band pass filter	Omega Optical	500DF20-9916	Equipment, 500±20nm
Band pass filter	Chroma Technology Corp.	60685	Equipment, 450±30nm
Calcium chloride solution	Sigma-aldrich	21114	Chemicals
carboxy-SNARF-1(AM)	Invitrogen	C1272	Chemicals
Charge-coupled device (CCD) camera	Philips	FTM1800NH/HGI	Equipment
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	86009	Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	567DCXRU	Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	480dclp	Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	20728	Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma-aldrich	154938	Chemicals
DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Sigma-aldrich	D5030	Chemicals
EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid	Sigma-aldrich	E4378	Chemicals
FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone	Sigma-aldrich	21857	Chemicals
field diaphragm	Nikon	86506	Equipment
Fura-2-FF(AM)	TEFLABS	137	chemicals
Green tube	DWM		test tube
HEPES,  4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma-aldrich	H3375	Chemicals
High-speed counter	National Instruments	NI-6022	Equipment
Hot mirror	Chroma Technology Corp.	21002	Equipment, 50:50
Inverted microscope	Nikon	TE-300	Equipment
Malate	Sigma-aldrich	27606	Chemicals
Near infrared filter	Chroma Technology Corp.	D750/100X	Equipment, 750±100nm
Oil immersion lens	Nikon	MRF01400	40x, NA 1.3; Equipment
Photon counter unit	Hamamatsu	C3866	Equipment
Photon multiplier tube	Hamamatsu	R2949	Equipment
Polychrome II	Till Photonics	SA3/MG04	Equipment
Potassium chloride	Merck	1.04936	Chemicals
Potassium hydroxide solution	Sigma-aldrich	P4494	Chemicals
Pyruvate	Sigma-aldrich	107360	Chemicals
Rotenone	Sigma-aldrich	R8875	Chemicals
Saponin	Sigma-aldrich	S4521	Chemicals
TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester	Molecular probes	T669	Chemicals