Ensaio de formação presynapse usando Presynapse organizador contas e "Neuron Ball" cultura
Summary
A formação de presynapse é um processo dinâmico que inclui a acumulação de proteínas sináptica na ordem apropriada. Neste método, a formação do presynapse é provocada pelos grânulos conjugados com uma proteína do organizador do presynapse em folhas axonal da cultura da esfera do Neuron do “”, de modo que a acumulação de proteínas sináptica seja fácil de ser analisada durante a formação do presynapse.
Abstract
Durante o desenvolvimento neuronal, a formação de sinapse é um passo importante para estabelecer circuitos neurais. Para formar sinapses, as proteínas sinápticas devem ser fornecidas em ordem apropriada pelo transporte de corpos celulares e/ou tradução local em sinapses imaturas. No entanto, não é totalmente compreendido como as proteínas sinápticas se acumulam em sinapses em ordem adequada. Aqui, nós apresentamos um método novo para analisar a formação pré-sináptica usando a combinação da cultura da esfera do neurônio com os grânulos para induzir a formação do presynapse. As esferas do Neuron que são agregados da pilha neuronal fornecem as folhas axonal longe dos corpos e dos dendrites da pilha, de modo que os sinais fluorescentes fracos dos presynapses possam ser detectados evitando sinais esmagadores de corpos da pilha. Como grânulos para desencadear a formação de presynapse, usamos grânulos conjugados com repetição rica em leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2), um organizador pré-sináptica excitatória. Usando este método, Nós demonstramos que o transportador vesicular 1 do glutamato (vGlut1), uma proteína sináptica do vesícula, acumulada em presynapses mais rapidamente do que Munc18-1, uma proteína da zona ativa. Munc18-1 acumulou a tradução-dependente no presynapse mesmo depois de remover corpos de pilha. Este achado indica o acúmulo de Munc18-1 por tradução local em axônios, não transporte de corpos celulares. Em conclusão, este método é apropriado analisar a acumulação de proteínas sináptica em presynapses e na fonte de proteínas sináptica. Como a cultura da esfera do neurônio é simples e não é necessário usar o instrumento especial, este método poderia ser aplicável a outras plataformas experimentais.
Introduction
A formação de sinapse é uma das etapas críticas durante o desenvolvimento de circuitos neurais1,2,3. A formação de sinapses especializadas em compartimentos compostos de pré e pós-sinapses é um processo complexo e multipasso que envolve o reconhecimento adequado de axônios e dendritos, formação de zona ativa e densidade pós-sináptica, e alinhamento adequado de canais iônicos e receptores neurotransmissores1,2. Em cada processo, muitos tipos de proteínas sinápticas se acumulam a estes compartimentos especializados em tempo adequado, transportando proteínas sinápticas de corpos celulares e/ou por tradução local nos compartimentos. Estas proteínas sinápticas são consideradas dispostas de forma organizada para formar sinapses funcionais. Disfunção de algumas proteínas sinápticas envolvendo a formação de sinapse resulta em doenças neurológicas4,5. Entretanto, permanece obscuro como as proteínas sináptica acumulam no sincronismo apropriado.
Para investigar como as proteínas sinápticas se acumulam de forma organizada, é necessário examinar a acumulação de proteínas sinápticas em ordem cronológica. Alguns relatos demonstraram imagens ao vivo para observar a formação de sinapse em cultura dissociada de neurônios6,7. Entretanto, é demorado encontrar os neurônios que apenas começam a formação do sinapse a microscopia. Para observar a acumulação de proteínas sinápticas de forma eficiente, a formação de sinapse deve começar no momento em que os pesquisadores querem induzir a formação. O segundo desafio é distinguir o acúmulo de proteínas sinápticas devido ao transporte de corpos celulares ou tradução local em sinapses. Para esse efeito, o nível de tradução é necessário para ser medido a condição de que não permite o transporte de proteínas sinápticas de corpos celulares.
Nós desenvolvemos o ensaio novo da formação do presynapse usando a combinação de cultura da esfera do neurônio com grânulos para induzir a formação do presynapse8. A cultura da esfera do Neuron é desenvolvida para examinar o phenotype axonal, devido à formação de folhas axonal que cercam corpos da pilha9,10. Foram utilizados grânulos magnéticos conjugados com repetição rica em leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2) que é um organizador pré-sináptico para induzir presynapses excitatórias (Figura 1a)11,12,13. Usando os grânulos LRRTM2, a formação do presynapse começa no momento em que os grânulos são aplicados. Isto significa que a formação de pré-sinapse começa em milhares de axônios de uma bola de neurônio ao mesmo tempo, assim, permite examinar o curso de tempos precisos de acumulação de proteínas sináptica eficientemente. Além disso, a cultura da bola de neurônio é fácil de bloquear o transporte de proteínas sinápticas de soma removendo corpos celulares (Figura 1b)8. Já confirmamos que os axônios sem corpos celulares podem sobreviver e são saudáveis pelo menos 4 h após a remoção de corpos celulares. Assim, este protocolo é adequado para investigar a partir de onde as proteínas sinápticas são derivadas (corpo celular ou AXON), e como as proteínas sinápticas se acumulam de forma organizada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós desenvolvemos o método novo para examinar a formação do presynapse estimulada com LRRTM2-Beads usando a cultura da esfera do neurônio. Atualmente, a maior parte do ensaio de formação pré-sinapse inclui grânulos revestidos de poli-D-lisina (PDL) e cultura dissociada/câmara microfluídica20,21,22. Uma das vantagens deste método é LRRTM2-Beads. Quando LRRTM2 interagir com o neurexin para dar forma a presynapses exci…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é parcialmente apoiado pelo JSPS Grant-in-Aid para a pesquisa científica (KAKENHI) (C) (no. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Agradecemos ao Dr. Terukazu Nogi e à Sra. Makiko Neyazaki (Universidade da cidade de Yokohama) por gentilmente fornecer proteína LRRTM2 biotinylated. Agradecemos também Honami Uechi e rie Ishii pela assistência técnica.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
Referências
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
- Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
- Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
- Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
- Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
- Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
- Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
- Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
- Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
- Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
- Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
- Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
