Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi
Summary
Målet med denne protokollen er å vise hvordan du bruker Lattice Light-Sheet Microscopy til firedimensjonalt visualisere overflatereseptordynamikk i levende celler. Her vises T-cellereseptorer på CD4+ primære T-celler.
Abstract
Signalingen og funksjonen til en celle dikteres av de dynamiske strukturene og interaksjonene til overflatereseptorene. For å virkelig forstå struktur-funksjon forholdet mellom disse reseptorene in situ, må vi visualisere og spore dem på live celleoverflaten med nok spatiotemporal oppløsning. Her viser vi hvordan du bruker nylig utviklet Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) til å bilde T-celle reseptorer (TCRs) firedimensjonalt (4D, rom og tid) på live celle membran. T-celler er en av de viktigste effektorcellene i det adaptive immunsystemet, og her brukte vi T-celler som et eksempel for å vise at signalog funksjon av disse cellene er drevet av dynamikken og interaksjonene til TCRs. LLSM tillater 4D-avbildning med enestående spatiotemporal oppløsning. Denne mikroskopiteknikken kan derfor vanligvis brukes på et bredt spekter av overflate- eller intracellulære molekyler av forskjellige celler i biologi.
Introduction
Den nøyaktige dynamikken i molekyler smugling og diffusering på tredimensjonal celleoverflaten i sanntid har vært en gåte å løse. Mikroskopi har alltid vært en balanse mellom hastighet, følsomhet og oppløsning; hvis en eller to er maksimert, minimeres den tredje. Derfor, på grunn av den lille størrelsen og enorme hastigheten som overflatereseptorer beveger seg, har sporing av dynamikken deres vært en stor teknologisk utfordring for cellebiologiens felt. For eksempel har mange studier blitt utført ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi1,2,3, som har høy temporal oppløsning, men kan bare bilde en veldig tynn skive av T-celle membran (~ 100 nm), og derfor savner hendelser som skjer lenger unna i cellen. Disse TIRF-bildene viser også bare en todimensjonal del av cellen. Derimot kan superoppløsningsteknikker, som stokastisk optisk rekonstruksjonmikroskopi (STORM)4, fotoaktivert lokaliseringmikroskopi (PALM)5og stimulert utslippsuttømmingsmikroskopi (STED)6, overvinne Abbe-diffraksjonsgrensen for lys. Disse teknikkene har høy romlig oppløsning (~ 20 nm oppløsning)4,5,6,7, men de tar ofte mange minutter å skaffe seg en full todimensjonal (2D) eller tredimensjonal (3D) bilde, og derfor temporal oppløsning går tapt. I tillegg kan teknikker som STORM og PALM som er avhengige av blinkende signaler ha unøyaktigheter i tellingen 8,9. Elektronmikroskopi har den klart høyeste oppløsningen (opptil 50 pm oppløsning)10; Det kan til og med gjennomføres tredimensjonalt med fokusert ionstråleskanning elektronmikroskopi (FIB-SEM), noe som resulterer i opptil 3 nm XY og 500 nm Z oppløsning11. Imidlertid krever enhver form for elektronmikroskopi hard prøveforberedelse og kan bare utføres med faste celler eller vev, noe som eliminerer muligheten for å forestille levende prøver over tid.
Teknikker for å oppnå den høye spatiotemporal oppløsning som kreves for å identifisere dynamikken i overflaten og intracellulære molekyler i levende celler i deres sanne fysiologiske 3D natur blir bare nylig utviklet. En av disse teknikkene er Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, som benytter et strukturert lysark til drastisk lavere fotobleking. Utviklet i 2014 av nobelprisvinner Eric Betzig, høy aksial oppløsning, lav fotobleking og bakgrunnsstøy, og evne til samtidig å bilde hundrevis av fly per synsfelt gjør LLS mikroskoper bedre enn widefield, TIRF og confocal mikroskoper12,13,14,15,16,17,18,19. Denne firedimensjonale (x, y, z og tid) bildeteknikk, mens fortsatt diffraksjon begrenset (~ 200 nm XYZ oppløsning), har utrolig temporal oppløsning (vi har oppnådd en bildefrekvens på ca 100 fps, noe som resulterer i en 3D rekonstruert cellebilde med 0,85 sekunder per ramme) for 3D romlig oppkjøp.
LLSM kan vanligvis brukes til å spore sanntidsdynamikk av molekyler i en hvilken som helst celle på enmolekyl- og encellenivå, spesielt de i svært motileceller som immunceller. For eksempel viser vi her hvordan du bruker LLSM til å visualisere T-cellereseptor (TCR) dynamikk. T-celler er effektorcellene i det adaptive immunsystemet. TCRs er ansvarlig for å gjenkjenne peptid-MHC (pMHC) ligander som vises på overflaten av antigenpresenterende celler (APC), som bestemmer valg, utvikling, differensiering, skjebne og funksjon av en T-celle. Denne anerkjennelsen skjer i grensesnittet mellom T-celler og APK-er, noe som resulterer i lokalisert reseptorklynge for å danne det som kalles immunologisk synapse. Mens det er kjent at TCRs ved immunologisk synapse er avgjørende for T-celle effektor funksjon, fortsatt ukjent er de underliggende mekanismene for sanntidTCR trafficking til synapse. LLSM har tillatt oss å visualisere i sanntid dynamikken i TCRs før og etter menneskehandel til synapse med den resulterende pMHC-TCR interaksjon (Figur 1). LLSM kan derfor brukes til å løse aktuelle spørsmål om den formative dynamikken til TCRs og gi innsikt for å forstå hvordan en celle skiller mellom selv og utenlandske antigener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte protokollen ble optimalisert for bruk av CD4+ T-celler isolert fra 5C. C7 transgene mus på LLSM-instrumentet som brukes, og derfor kan andre cellesystemer og LLSMer kanskje må optimaliseres annerledes. Denne protokollen viser imidlertid kraften i 4D-avbildning, da den kan brukes til å kvantifisere dynamikken i en overflatereseptor på en hel celle med minst forvrengning i fysiologiske forhold. Derfor er det mange mulige fremtidige anvendelser av denne teknikken.
E…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne anerkjenne råd og veiledning fra Dr. Vytas Bindokas ved University of Chicago. Vi takker Integrated Light Microscopy Core Facility ved University of Chicago for å støtte og vedlikeholde gitterets lysarkmikroskop. Dette arbeidet ble støttet av NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 og NSF Career Award 1653782 (Til J.H.). J.R. støttes av NSF Graduate Research Fellowships Program.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
Referências
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- . Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019)
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
