Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía
Summary
El objetivo de este protocolo es mostrar cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía para visualizar la dinámica de receptores de superficie en células vivas. Aquí se muestran los receptores de células T en CD4+ células T primarias.
Abstract
La señalización y la función de una célula están dictadas por las estructuras dinámicas y las interacciones de sus receptores de superficie. Para entender realmente la relación estructura-función de estos receptores in situ, necesitamos visualizarlos y rastrearlos en la superficie celular viva con suficiente resolución espaciotemporal. Aquí mostramos cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía (LLSM) recientemente desarrollada para crear imágenes de receptores de células T (TPR) en cuatro dimensiones (4D, espacio y tiempo) en la membrana celular viva. Las células T son una de las principales células efector del sistema inmune adaptativo, y aquí usamos las células T como ejemplo para mostrar que la señalización y la función de estas células son impulsadas por la dinámica y las interacciones de losTPR. LLSM permite imágenes 4D con una resolución espaciotemporal sin precedentes. Por lo tanto, esta técnica de microscopía se puede aplicar generalmente a una amplia gama de moléculas superficiales o intracelulares de diferentes células en biología.
Introduction
La dinámica precisa del tráfico y difusión de moléculas en la superficie celular tridimensional en tiempo real ha sido un enigma a resolver. La microscopía siempre ha sido un equilibrio entre velocidad, sensibilidad y resolución; si uno o dos se maximizan, el tercero se minimiza. Por lo tanto, debido al pequeño tamaño y la inmensa velocidad con la que se mueven los receptores de superficie, el seguimiento de su dinámica ha seguido siendo un gran desafío tecnológico para el campo de la biología celular. Por ejemplo, muchos estudios se han realizado utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)1,2,3, que tiene alta resolución temporal, pero sólo puede imaginar una rebanada muy delgada de la membrana de la célula T (100 nm), y por lo tanto echa de menos eventos que ocurren más lejos en la célula. Estas imágenes TIRF también muestran solo una sección bidimensional de la celda. Por el contrario, las técnicas de superresolución, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM)4, la microscopía de localización fotoactivada (PALM)5y la microscopía de agotamiento de emisiones estimulada (STED)6,pueden superar el límite de difracción de la luz de Abbe. Estas técnicas tienen una alta resolución espacial (resolución de 20 nm)4,5,6,7, pero a menudo tardan muchos minutos en adquirir una imagen bidimensional completa (2D) o tridimensional (3D), y por lo tanto se pierde la resolución temporal. Además, técnicas como STORM y PALM que dependen de señales parpadeantes pueden tener imprecisiones en el conteo8,9. La microscopía electrónica tiene con mucho la resolución más alta (resolución de hasta 50 pm)10; incluso se puede llevar a cabo tridimensionalmente con microscopía electrónica de barrido de haz iónico focalizado (FIB-SEM), lo que resulta en hasta 3 nm XY y 500 nm Z resolución11. Sin embargo, cualquier forma de microscopía electrónica requiere una preparación dura de la muestra y sólo se puede llevar a cabo con células o tejidos fijos, eliminando la posibilidad de tomar imágenes de muestras en vivo a lo largo del tiempo.
Técnicas para obtener la alta resolución espaciotemporal necesaria para identificar la dinámica de las moléculas superficiales e intracelulares en células vivas en su verdadera naturaleza fisiológica 3D sólo se está desarrollando recientemente. Una de estas técnicas es Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, que utiliza una hoja de luz estructurada para reducir drásticamente el fotoblanqueo. Desarrollado en 2014 por el Premio Nobel Eric Betzig, la alta resolución axial, bajo fotoblanqueo y ruido de fondo, y la capacidad de crear simultáneamente imágenes de cientos de planos por campo de visión hacen que los microscopios LLS sean superiores a los microscopios de campo ancho, TIRF yconfocal12,13,14,15,16,17,18,19. Esta técnica de imagen de cuatro dimensiones (x, y, z y tiempo), aunque todavía difracción limitada (resolución XYZ de 200 nm), tiene una resolución temporal increíble (hemos logrado una velocidad de fotogramas de unos 100 fps, lo que resulta en una imagen de celda reconstruida en 3D con 0,85 segundos por fotograma) para la adquisición espacial 3D.
LLSM se puede utilizar generalmente para rastrear la dinámica en tiempo real de cualquier molécula dentro de cualquier célula a nivel de una sola molécula y una sola célula, particularmente aquellas en células altamente móviles como las células inmunes. Por ejemplo, mostramos aquí cómo utilizar LLSM para visualizar la dinámica del receptor de células T (TCR). Las células T son las células efector del sistema inmunitario adaptativo. Las TPR son responsables de reconocer los ligandos peptídicos-MHC (pMHC) que se muestran en la superficie de las células que presentan antígenos (APC), que determina la selección, desarrollo, diferenciación, destino y función de una célula T. Este reconocimiento se produce en la interfaz entre las células T y los AAP, lo que resulta en clustering de receptores localizados para formar lo que se llama la sinapsis inmunológica. Si bien se sabe que los TCR en la sinapsis inmunológica son imperativos para la función del efector de células T, todavía desconocidos son los mecanismos subyacentes del tráfico de TCR en tiempo real a la sinapsis. LLSM nos ha permitido visualizar en tiempo real la dinámica de los TCR antes y después del tráfico a la sinapsis con la interacción resultante pMHC-TCR(Figura 1). Por lo tanto, llSM se puede utilizar para resolver cuestiones actuales de la dinámica formativa de los TPR y proporcionar información para entender cómo una célula distingue entre antígenos uno mismo y otros.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado fue optimizado para el uso de células CD4+ T aisladas de 5C. Los ratones transgénicos C7 en el instrumento LLSM utilizado, y por lo tanto otros sistemas celulares y LLSM pueden necesitar ser optimizados de manera diferente. Sin embargo, este protocolo muestra la potencia de las imágenes 4D, ya que se puede utilizar para cuantificar la dinámica de un receptor de superficie en una célula entera con la menor distorsión en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, hay muchas posibles a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer el consejo y la orientación del Dr. Vytas Bindokas de la Universidad de Chicago. Agradecemos a la Instalación Central integrada de microscopía de luz de la Universidad de Chicago por apoyar y mantener el microscopio de lámina de luz de celosía. Este trabajo fue apoyado por NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 y NSF Career Award 1653782 (A J.H.). J.R. cuenta con el apoyo del Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la NSF.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
Referências
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