Dit protocol beschrijft een originele Setup met een combinatie van spectrale en fluorescentie levensduur metingen om Förster Resonance Energy Transfer (FRET) te evalueren tussen de op Rhodamine gebaseerde fluorescentie sondes en lignine Polymer rechtstreeks in dikke plantendelen.
In lignocellulosische biomassa (LB) wordt de activiteit van enzymen beperkt door het verschijnen van niet-specifieke interacties met lignine tijdens het hydrolyseproces, dat enzymen ver van hun substraat handhaaft. Karakteriseren van deze complexe interacties is dus een uitdaging in complexe substraten zoals LB. De methode hier meet de moleculaire interacties tussen met fluorophore gelabelde moleculen en inheemse autofluorescerende lignine, die door Förster Resonance Energy Transfer (FRET) worden onthuld. In tegenstelling tot FRET metingen in levende cellen die twee exogene fluor Foren gebruiken, is FRET metingen in planten die lignine gebruiken niet triviaal vanwege de complexe auto fluorescentie. We hebben een originele pijpleiding voor acquisitie en analyse ontwikkeld met gecorreleerde observatie van twee complementaire eigenschappen van fluorescentie: fluorescentie-emissie en levensduur. sFLIM (spectrale en fluorescerende levensduur Imaging microscopie) biedt de kwantificering van deze interacties met hoge gevoeligheid, waardoor verschillende interactieniveaus tussen biomoleules en lignine worden onthuld.
Het hydrolyseren van lignocellulose in monomere suikers zoals glucose vereist enzymen. Het is bekend dat hun activiteit wordt beperkt door het vaststellen van niet-specifieke interacties tussen enzymen en lignine1,2, waarbijdeze laatste een hydrofoob polymeer is en een belangrijk bestanddeel van lignocellulose3. Daarom is het kwantitatief meten van dergelijke interacties direct op de cellulaire schaal een uitdaging die moet worden aangepakt om de enzym katalytische activiteit en de lignocellulose voorbehandeling4te optimaliseren.
Förster (of fluorescentie) Resonance Energy Transfer (fret)-meting is een methode om de interactie van biomoleculen in situ te beoordelen. Deze niet-radioatieve energie overdracht kan optreden tussen een donor en een acceptor de als ze aan verschillende voorwaarden voldoen. Het emissiespectrum van de donor moet ten minste gedeeltelijk overlappen met het bekrachtigings spectrum van de accepteurs. De keuze van fluoroforen is dus cruciaal voor dergelijke experimenten. Vervolgens neemt de overdrachts efficiëntie af met de zesde kracht van hun afstand5 en treedt alleen op als beide moleculen in de buurt zijn (meestal in het nanometer-bereik). Andere onvoorziene omstandigheden kunnen de overdrachts efficiëntie wijzigen, zoals dipool-dipool oriëntatie, maar worden verzacht als fluoroforen flexibiliteit hebben.
FRET kan worden gemeten met verschillende technieken en gedetailleerde beschrijvingen zijn te vinden in de literatuur6,7. In het kort, de belangrijkste methoden vertrouwen op: i) gesensibiliseerde emissie waarin de variatie van de acceptor emissie fluorescentie wordt gevolgd en levert voornamelijk kwalitatieve resultaten op; II) foto bleking acceptor waarbij de emissie van de donor fluorescentie wordt gemeten vóór en na acceptatie van foto bleken (in dit geval kunnen preciezere FRET schattingen worden bereikt, maar vereisen sterke Laser kracht toegepast op vaste monsters); en III) levenslange meting die afneemt voor de donor in aanwezigheid van de acceptor. Deze methode vereist specifieke instrumenten en maakt nauwkeurige en gevoelige interactie metingen tussen fluoroforen mogelijk. Gezien de fret meting tussen fluorescentie sondes en lignocellulose, is het grootste probleem dat lignocellulose geen enkele goed gekarakteriseerde fluorophore is: het heeft een sterke inheemse en spectraal-brede autofluorescentie, voornamelijk afkomstig van lignine, en afhankelijk van biomassa soorten8,9.
In dit artikel stellen we een nieuwe en originele procedure voor die is aangepast aan secties van hout/plantaardige monsters. Deze sFLIM gebaseerde methode opent de weg naar kwantitatieve FRET metingen tussen fluorescentie sondes en lignine in inheemse lignocellulose samples.
Het correleren van fluorescentie levensduur en emissiespectrum metingen maakt het combineren van voordelen van beide methoden mogelijk. Inderdaad, spectrale metingen alleen gebrek aan gevoeligheid en blijven kwalitatief. Aan de andere kant is de levensduur van fluorescentie de methode van keuze voor traditionele kwantitatieve FRET-metingen, maar er werd aangetoond dat lignine-autofluorescentie kan variëren afhankelijk van lignine-samenstelling en omgeving16. Lignine interacties met een acceptor of lignine structurele veranderingen kunnen dus niet worden gediscrimineerd omdat ze beiden resulteren in een levenslange afname. Zoals aangetoond, biedt de ontwikkelde methode ondubbelzinnige, gevoelige en kwantitatieve meting van interacties tussen lignine en acceptor moleculen in planten secties. Zelfs als de verschillende stappen van de methode rigoureus zijn geoptimaliseerd, moet met name voorzichtigheid worden betracht voor de volgende punten.
Met betrekking tot de monsters is de kwaliteit van de installatie sectie van cruciaal belang om in-focus beeldvorming te waarborgen. De verschillende stappen voor het insluiten van PEG moeten strikt worden gevolgd. De laatste wasstap is essentieel om ervoor te zorgen dat er geen interferentie van PEG in de monsters overblijft. Bovendien moeten buffer concentratie en pH strikt identiek worden gehouden voor alle metingen, omdat elke verandering een sterke invloed kan hebben op fluorescentie eigenschappen.
Levenslange meting kan ook delicaat zijn. De fluorescentie levensduur van de donor kan instabiel zijn, bijvoorbeeld vanwege een hoge excitatie. In een dergelijk geval kan het probleem worden opgelost door de laser stroom te tunen en de zoom in te zoomen. Een andere bekende bron van artefacten in de tcspc-metingen is foton Pulse pile-up. TCSPC kan namelijk de snelheid van twee fotonen die tussen dezelfde twee laserpulsen worden uitgezonden, niet meten. Terwijl plantaardige monsters zijn sterk gestructureerd, de fluorescentie is niet homogeen en kan leiden tot een verborgen puls botsing effect. Hoewel het aantal fotonen per seconde onder de 1%-excitatie limiet blijft, kan het in sommige steekproef gebieden hoger zijn. Om te zorgen voor geen botsing experimenten, kan worden overwogen om de levensduur van de donor fluorescentie te meten bij een andere foonflux. Als de levensduur toeneemt terwijl de flux afneemt, is een botsing effect het wijzigen van metingen. Optimale lichtstroom wordt bereikt met de levenslange stabiliteit van de donor.
Met betrekking tot sFLIM Decay Curve Analysis, raden we aan om te vertrouwen op elke individuele curve pasvorm om ervoor te zorgen dat het model nauwkeurig metingen beschrijft. Als dit niet het geval is, zorg er dan eerst voor dat geen van de eerder genoemde artefacten de gegevens hebben beschadigd. Vervolgens biedt stap 2.1.4 de instrumentale respons functie (IRF) van het systeem. Als IRF enkele anomalieën vertoont, optimaliseert u het optische pad om deze te minimaliseren. Een gemeten IRF voor montage tijdens stap 6,2 kan ook worden gebruikt. Tot slot kan de vrijheidsgraden van het model worden verhoogd tot een drie-exponentieel verval in stap 6,2. Het aantal fotonen dat nodig is voor de individuele levensduur en de bepaling van de proporties is echter hoog en daarom wordt het aanbevolen alleen te gebruiken om een stabielere gemiddelde levensduur te bereiken vanaf stap 6,4. Meer uitputtende informatie over FLIM, de karakterisering18, sflim en de toepassing ervan12 met name lignine10, kan worden gevonden in de literatuur.
Hoewel uitdagende, FRET meting in plantenweefsels met behulp van inheemse auto fluorescentie toont enkele voordelen. In vergelijking met FRET metingen uitgevoerd op levende weefsels waarin interactiestudies tussen biomoleules vaak vereist genetische manipulatie om intrinsieke fluorescerende markers uitdrukken, lignified plant weefsels zoals die hier gepresenteerd, bieden natuurlijke auto fluorescentie, en extrinsieke partner fluorescentie sondes kunnen gemakkelijk worden toegevoegd, waardoor veel tijd wordt bespaard. Echter, afhankelijk van de geanalyseerde plantensoorten en de mogelijke voor behandelingen die worden uitgevoerd, is het waarschijnlijk dat autofluorescentie wordt aangepast, zodat het zorgvuldig moet worden gekarakteriseerd en het gebruik van de als sondes mogelijk moet worden aangepast.
De sFLIM-methode moet worden toegepast op fluorescentie sondes zonder katalytische activiteit (PEG en dextran). In het kader van de installatie van lignocellulose hydrolyse kunnen interacties van enzymen in verschillende biomassa monsters worden uitgevoerd, wat mogelijk resulteert in de bepaling van de impact van lokalisatie (cellen en weefsels) op de interactie sterkte. De volgende optimalisatie stap is automatisering van de analyse stap. Inderdaad, met voldoende geanalyseerde gegevens, zou een machine learning-based analyseprocedure kunnen worden ingezet voor geautomatiseerde fenotype analyse, waardoor de mogelijkheid tot snelle screening van enzym-biomassa-efficiëntie zou toenemen. Bovendien vereist sFLIM geen fixatie van het monster en kan het gemakkelijk worden toegepast op dynamische enzym-lignine-interactiestudies. Een dergelijke unieke methode is waarschijnlijk het begeleiden van de enzym engineering strategie en biomassa voor behandeling om lignocellulose valorisatie te optimaliseren.
The authors have nothing to disclose.
Fanny Laurent (FARE) wordt hartelijk bedankt voor de voorbereiding van de figuren. De Onderzoeksfederatie FRABio (Universiteit van Lille, CNRS) wordt erkend voor het leveren van de technische omgeving die bevorderlijk is voor het bereiken van dit werk. De financiering werd verkregen van het Franse nationale onderzoeksbureau (LIGNOPROG project ANR-14-CE05-0026).
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |