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Genetics

चावल की एक लिंग आबादी में पिघल उच्च संकल्प द्वारा उत्परिवर्तनों की पहचान

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/59960
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4
1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

Summary

इस आलेख में, हम प्रोटोकॉल जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलने विश्लेषण (HRM)-आधारित लक्ष्य प्रेरित स्थानीय Lesions जीनोम्स में (TILLING) के रूप में वर्णित है प्रस्तुत करते हैं। यह विधि डीएनए डुप्लेक्स के पिघलने के दौरान फ्लोरोसेंट परिवर्तन का उपयोग करती है और प्रविष्टि/विलोपन (इंडेल) और एकल आधार सबस्टिशन (एसबीएस) दोनों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है।

Abstract

लक्ष्य प्रेरित स्थानीय Lesions में जीनोम्स (TILLING) प्रेरित उत्परिवर्तनों के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए रिवर्स आनुवंशिकी की एक रणनीति है. हालांकि, TILLING प्रणाली प्रविष्टि के लिए कम प्रयोज्यता है / विलोपन (इंडेल) का पता लगाने और पारंपरिक TILLING अधिक जटिल कदम की जरूरत है, सीईएल मैं nuclease पाचन और जेल electrophoresis की तरह. थ्रूपुट और चयन दक्षता में सुधार करने के लिए, और दोनों Indels और एकल आधार substitions (SBSs) संभव की स्क्रीनिंग बनाने के लिए, एक नया उच्च संकल्प पिघलने (HRM) आधारित TILLING प्रणाली विकसित की है. यहाँ, हम एक विस्तृत HRM-TILLING प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग में इसके आवेदन को दिखाते हैं। इस विधि उच्च तापमान पर डबल-स्ट्रेंड डीएनए के विकृतीकरण को मापने के द्वारा पीसीआर amplicons के उत्परिवर्तनों का विश्लेषण कर सकते हैं। HRM विश्लेषण सीधे अतिरिक्त संसाधन के बिना पोस्ट-पीसीआर किया जाता है। इसके अलावा, एक सरल, सुरक्षित और तेजी से (एसएसएफ) डीएनए निष्कर्षण विधि दोनों Indels और SBS की पहचान करने के लिए एचआरएम-टिलिंग के साथ एकीकृत है। इसकी सादगी, मजबूती और उच्च थ्रूपुट यह चावल और अन्य फसलों में उत्परिवर्तन स्कैनिंग के लिए संभावित रूप से उपयोगी बनाते हैं।

Introduction

उत्परिवर्ती संयंत्र कार्यात्मक जीनोमिक्स अनुसंधान और नई किस्मों के प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण आनुवंशिक संसाधन हैं। एक आगे आनुवंशिकी दृष्टिकोण (यानी उत्परिवर्ती चयन से जीन क्लोनिंग या विविधता के विकास के लिए) के बारे में प्रेरित उत्परिवर्तनों के उपयोग के लिए मुख्य और एकमात्र विधि के रूप में इस्तेमाल किया 20 साल पहले. एक उपन्यास रिवर्स आनुवंशिकी विधि का विकास, TILLING (Targeting प्रेरित स्थानीय Lesions जीनोम्स में) McCallum एट अल द्वारा1 एक नया प्रतिमान खोला और यह तब से पशु और संयंत्र प्रजातियों की एक बड़ी संख्या में लागू किया गया है2. TILLING विशेष रूप से लक्षण है कि तकनीकी रूप से मुश्किल है या निर्धारित किया जा करने के लिए महंगा कर रहे हैं प्रजनन के लिए उपयोगी है (उदाहरण के लिए, रोग प्रतिरोध, खनिज सामग्री).

TILLING शुरू में रासायनिक mutagens द्वारा प्रेरित स्क्रीनिंग बिंदु उत्परिवर्तनों के लिए विकसित किया गया था (उदाहरण के लिए, ईएमएस1,3). यह निम्नलिखित कदम शामिल हैं: एक टिलरिंग आबादी की स्थापना (ओं); डीएनए तैयारी और अलग-अलग पौधों का पूलिंग; पीसीआर लक्ष्य डीएनए टुकड़ा के प्रवर्धन; HEteroduplexes गठन विकृतीकरण और पीसीआर amplicons और सीईएल मैं nuclease द्वारा दरार के अनीलन द्वारा; और उत्परिवर्ती व्यक्तियों और उनके विशिष्ट आणविक घावों की पहचान3,4. हालांकि, इस विधि अभी भी अपेक्षाकृत जटिल है, समय लगता है, और कम throughput. इसे और अधिक कुशल और उच्च थ्रूपुट के साथ बनाने के लिए, कई संशोधित टिलिंग विधियों को विकसित किया गया है, जैसे विलोपन टिलिंग (डी-टिलरिंग) (तालिका 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

एचआरएम वक्र विश्लेषण, जो डीएनए डुप्लेक्स के पिघलने के दौरान फ्लोरोसेंट परिवर्तन पर आधारित है, उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग और जीनोटाइपिंग13के लिए एक सरल, लागत प्रभावी, और उच्च थ्रूपुट विधि है। एचआरएम पहले से ही ईएमएस mutagenesis14द्वारा प्रेरित एसबीएस उत्परिवर्तनों की जांच के लिए एचआरएम आधारित टिलरिंग (एचआरएम-टिलरिंग) सहित संयंत्र अनुसंधान में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम चावल में गामा (जेड) किरणों से प्रेरित उत्परिवर्तनों (दोनों Indel और एसबीएस) की स्क्रीनिंग के लिए विस्तृत HRM-TILLING प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया।

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Protocol

1. तैयारी

  1. जेड-रे mutagenized आबादी का विकास
    1. लगभग 20,000 सूखे चावल के बीजों का इलाज करें (के नमी सामग्री के साथ 14%) एक Japonica चावल लाइन (उदा., DS552) के साथ 137Cs गामा किरणों के साथ 100 Gy (1 Gy/min) में एक $ विकिरण सुविधा (उदा., गामा सेल).
      नोट:उपचार के लिए उपयोग किए जाने वाले बीजों में उच्च व्यवहार्यता होनी चाहिए (उदाहरण के लिए, अंकुरण दर के साथ। इंडिका चावल के लिए विकिरण खुराक को 150 Gy तक बढ़ाया जा सकता है।
    2. अंकुर बिस्तर पर अंकुरण के बाद विकिरणित बीज बोना और धान के खेत में व्यक्तिगत रूप से पौधे रोपें और एम1 आबादी में वृद्धि करें।
      नोट:श्रम लागत को बचाने के लिए एम1 पौधों की सीधी बुआई भी कम से कम लागू की जा सकती है। शारीरिक या जैविक अलगाव का उपयोग कर अन्य चावल की किस्मों के साथ एम1 पौधों के बाहर जाने से रोकें।
    3. M1 पौधों से थोक फसल M2 बीज, प्रत्येक एम1 आतंक से 1-2 बीज के साथ, एक एम2 जनसंख्या बनाने के लिए.
      नोट: व्यवहार में और सादगी के लिए, एम1 पौधों के सभी बीज फसल और पूरी तरह से मिश्रण के बाद, एक भाग एक एम2 जनसंख्या के रूप में नमूना है।
    4. कमरे के तापमान पर लगभग 5,000 एम2 बीज को पानी में 24 (इंडिका चावल)-36 (जैपोनिका चावल) एच के लिए भिगो दें। फिर पेट्री व्यंजन में नम फिल्टर पेपर पर 2 दिनों के लिए बीज 37 डिग्री सेल्सियस पर अंकुरित होने दें।
      नोट:अधिक एम2 बीज उत्परिवर्ती की पहचान करने की संभावना को बढ़ाने के लिए विश्लेषण के लिए अंकुरित किया जा सकता है।
    5. छोटे छेद के साथ बोने पैनलों के लिए अंकुरित बीज प्लेस और उन्हें एक संस्कृति योशिदा एट अल से संशोधित संस्कृति समाधान में 3-4 सप्ताह के लिए hydroponically हो जाना 15 एक 12 h photoperiod के साथ एक ग्लासहाउस में [दिन (30 डिग्री 2) ] और रात (24 डिग्री 2) [सी].
  2. पत्ती के ऊतकों का नमूना: एक छेद पंचर का उपयोग कर एक ही स्थिति में प्रत्येक बोने की पूरी तरह से विस्तारित पत्ती से एक डिस्क (जेड 2 मिमी) काटें।
  3. डीएनए निष्कर्षण समाधान की तैयारी
    1. बफर ए: 5 एम NaOH के 2 एमएल और 20% ट्वीन 20 के 10 एमएल जोड़ें 50 एमएल के अंतिम मात्रा बनाने के लिए। डीएनए निष्कर्षण से पहले नए सिरे से बफर ए तैयार करें।
    2. बफर बी: 1 M Tris-HCl (पीएच 8.0) के 20 एमएल और 100 एमएल की एक अंतिम मात्रा बनाने के लिए 0.5 M EDTA के 80 डिग्री एल जोड़ें।
  4. पीसीआर प्राइमर
    1. HRM विश्लेषण के लिए प्राइमर: सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लक्ष्य अनुक्रम के प्रवर्धन के लिए प्राइमर डिजाइन (उदाहरण के लिए, प्राइमर प्रीमियर5) और एक वाणिज्यिक कंपनी द्वारा संश्लेषित।
      नोट:क्योंकि HRM कम लंबे टुकड़े के विश्लेषण के लिए लागू होता है, और इसलिए, amplicons से कम होना चाहिए 400 bp. बहुत अधिक के साथ टुकड़े (gt; 75%) या बहुत कम (lt;25%) जीसी सामग्री भी एचआरएम विश्लेषण के लिए अच्छा नहीं कर रहे हैं।
    2. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्राइमर: पेंग एट अल 16 से 12 चावल गुणसूत्रोंपर वितरित 24 एसएसआर मार्करों का उपयोग करें।

2. डीएनए निष्कर्षण

  1. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से में 4 पत्ती डिस्क प्लेस, बफर एक समाधान जोड़ें (50 एमएल / 10 मिनट के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में थाली फ्रीज.
  2. कमरे के तापमान पर प्लेट को फ्रीज करें, और फिर 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से बफर बी के 50 डिग्री एल जोड़ें और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण.
  4. 1,500 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेंट पीसीआर के लिए तैयार है।

3. पीसीआर प्रवर्धन

  1. पीसीआर अनुकूलन
    1. प्रत्येक पीसीआर के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों को अच्छी तरह से जोड़ें: डीएनए के 1 जेडएल (चरण 2.4 में supernatant), 2x मास्टर मिक्स के 5 डिग्री एल (2x पीसीआर बफर, 4 mmol/L MgCl2, 0.4 mmol/L 2'-deriboxyonucleoside triphosphates (dNTPs), और 50 U/mL Tak DNA polymeras, 0.20 [mol/L प्राइमर, और एक अंतिम मात्रा बनाने के लिए 10 $L nuclease मुक्त पानी का उपयोग कर.
    2. निम्नलिखित PCR प्रोग्राम का उपयोग करके प्रत्येक लक्ष्य खंड के लिए इष्टतम annealing तापमान निर्धारित करने के लिए एक ढाल-सक्षम थर्मल ब्लॉक का उपयोग करें: 94 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 94 डिग्री सेल्सियस पर 30 s के 40 चक्र के बाद, 30 एस पर 52-62 डिग्री सेल्सियस (ग्रेडिएंट तापमान), और 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 s , 8 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार और 16 डिग्री सेल्सियस पर एक पकड़ के साथ।
    3. इष्टतम अनीलन तापमान के निर्धारण के लिए 1% agarose जैल पर amplicons की जांच.
      नोट:एक इष्टतम annealing तापमान लक्ष्य टुकड़ा के विशिष्ट प्रवर्धन सक्षम करना चाहिए, nonspecific प्रवर्धन और प्राइमर dimerization के बिना.
  2. एचआरएम विश्लेषण के लिए पीसीआर
    नोट:HRM संगत प्लेटें और एम2 अंकुर के डीएनए के रूप में निकाला चरण 2.4 में वर्णित पीसीआर के लिए उपयोग किया जाता है.
    1. 10 डिग्री सेल्सियस की अंतिम मात्रा में पीसीआर निष्पादित करें, 1 जेडएल के साथ डीएनए (सुपरनेटेंट), 2x मास्टर मिक्स के 5 डिग्री एल, 0.2 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक 10 $mol/L प्राइमर, और 1 x fluorscence डाई के 1 $L. प्रत्येक प्लेट में एक जंगली प्रकार (WT) parented नमूना और एक नकारात्मक (डीएनए के बिना) नियंत्रण शामिल हैं.
    2. वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से खनिज तेल की एक बूंद जोड़ें.
    3. चिपकने वाला फिल्म और 1 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के साथ प्लेट सील करें।
    4. अनुकूलित अनीलन तापमान का उपयोग करके PCR चलाएँ.
      नोट:कुछ मामलों में, फ्लोरोसेंट डाई पीसीआर प्रवर्धन को प्रभावित कर सकता है, इसलिए डाई पीसीआर के पूरा होने के बाद जोड़ा जाता है। ऐसे मामलों में, डाई के बाद पीसीआर denaturing और annealing द्वारा डीएनए किस्में में शामिल किया गया है.

4. एचआरएम स्कैनिंग और उत्परिवर्तन पुष्टिकरण

  1. चिपकने वाला फिल्म प्लेट से निकालें और एक HRM मशीन में थाली डालें.
  2. फ़ाइल मेनू से नया चलाएँ का चयन करें या स्क्रीन के शीर्ष पर चलाएँ बटन दबाएँ.
  3. पिघल के लिए प्रारंभ और अंत तापमान 55 डिग्री सेल्सियस से 95 डिग्री सेल्सियस तक निर्दिष्ट करें।
    नोट:पहले रन के बाद, पिघल तापमान की सीमा एक विशेष टुकड़ा के लिए निर्धारित किया जा सकता है; इसलिए, पिघल तापमान समय बचाने के लिए एक ही टुकड़ा के बाद के विश्लेषण के लिए समायोजित किया जा सकता है।
  4. उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण के लिए नमूने का चयन करें, नकारात्मक नियंत्रण के समान नमूने बाहर.
  5. एक ही शुरुआत और अंत फ्लोरोसेंट के लिए पिघलने घटता सामान्य. नेत्रहीन पुष्टि करें कि कम न्यूनतम और निचले मैक्स तापमान कर्सर घटता के एक क्षेत्र में हैं.
  6. 0.05 की डिफ़ॉल्ट सेटिंग पर $F (fluorscence का अंतर) स्तर रखें।
  7. मानक चयन सूची से सामान्य बनाम भिन्न का चयन करें और सामान्य संवेदनशीलता चुनें.
  8. नियंत्रण के रूप में WT का प्रयोग करें; WT से $0.05 के $F मान वाले नमूनों में उत्परिवर्ती पादन माना जाता है।
  9. पहचान और उत्परिवर्ती पौधों की पुष्टि.
    1. चार पौधों की पहचान, जिनमें से प्रत्येक उत्परिवर्ती पूल बनाया गया था.
    2. कुछ संशोधनों के साथ एलन एट अल 17 के अनुसार एक CTAB विधि का उपयोग कर इन पौधों में से प्रत्येक से डीएनए निकालें.
      नोट:DNase मुक्त RNase और NaAc का उपयोग नहीं कर रहे हैं जब एलन एट अल द्वारा वर्णित CTAB विधि का उपयोग कर डीएनए निकालने 17, के रूप में डीएनए की गुणवत्ता आगे पीसीआर प्रवर्धन के लिए काफी अच्छा है. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर परिमाणीकरण के बाद $ 25 एनजी/
    3. पीसीआर प्राइमर का उपयोग कर के लक्ष्य टुकड़ा बढ़ाना और HRM विश्लेषण के लिए के रूप में एक ही कार्यक्रम.
    4. उंर्णके के संगर अनुक्रमण द्वारा विशिष्ट आण्विक घावों की पहचान करें।
      नोट:पीसीआर प्रवर्धन के पूरा होने के बाद, Sanger अनुक्रमण के लिए एक कंपनी के लिए amplicons भेजें. आणविक घाव एम2 संयंत्र और WT के बीच दृश्यों की तुलना करके पहचाना जा सकता है.

5. आणविक मार्करों के साथ चयनित उत्परिवर्ती की गुणवत्ता नियंत्रण

  1. जीनोमिक डीएनए के 25 एनजी के साथ 10 डिग्री सेल्सियस की अंतिम मात्रा में 24 एसएसआर मार्करों के लिए पीसीआर निष्पादित करें (CTAB प्रोटोकॉल का उपयोग करके निकाला गया), 2x मास्टर मिश्रण का 5 $L, 10 डिग्री एसएसआर प्राइमर में से प्रत्येक के 0.2 डिग्री एल।
  2. निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करपीसी चलाएँ: 94 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, इसके बाद 94 डिग्री सेल्सियस पर 30 s के 30 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 s और 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 s, 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार के साथ 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 7 मिनट के लिए।
  3. 8% पॉलीऐक्रिलमाइड जैल पर प्रवर्धकों को अलग करें और 18चांदी के दाग से प्रवर्धित टुकड़ों के बहुरूपता को प्रकट करें .
  4. चयनित वेरिएंट और WT के SSR haplotypes की तुलना करें.
    नोट:प्रेरित उत्परिवर्ती अक्सर एसएसआर haplotypes उनके WT करने के लिए समान है, अगर एक से अधिक SSR मार्करों एक संस्करण और WT के बीच अलग हैं, संस्करण एक आनुवंशिक संदूषक होने की संभावना अधिक है (जैसे, एक मिश्रण या outcrossed संयंत्र) के बजाय एक प्रेरित उत्परिवर्ती18|

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Representative Results

एचआरएम स्कैनिंग और विश्लेषण

कुल में, 1,140 जमा डीएनए नमूने से 4,560 एम2 अंकुर का उत्पादन किया गया और पीसीआर प्रवर्धन के अधीन. 195 बीपी और 259 बीपी के आकार वाले दो खंडों को क्रमश : OsLCT1 और SPDTके लिए परिलक्षित किया गया (सारणी 2) . अधिकांश नमूनों में पिघलने के वक्र डब्ल्यूटी (जेडएफ और 0.05) से काफी अलग नहीं थे। एचआरएम वक्र्स डब्ल्यूटी (जेडएफ और 0.05) से काफी अलग हैं, सॉफ्टवेयर द्वारा WT से अलग रंग (ओं) के साथ समूहीकृत किए गए थे (चित्र 1)।

म्यूटेशन पुष्टिकरण और आवृत्ति

एक व्यक्ति अंकुर से एक डीएनए नमूना प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया गया था और संबंधित टुकड़ा अनुक्रम था. जीनों पर उत्परिवर्तन प्रकार और स्थिति की अनुक्रमण वर्णलेखों द्वारा पुष्टि की जा सकती है (चित्र 2) . 4,560 एम2 अंकुरों (सारणी2) से दो इंडल और एक एसबीएस सहित तीन उत्परिवर्तनों की पहचान की गई थी। यह पाया गया कि सभी तीन उत्परिवर्ती भाग उत्परिवर्तन स्थल पर विषमयुग्मज थे (चित्र 2) ।

यहाँ उत्परिवर्तन आवृत्ति को उत्परिवर्तन की आवृत्ति के रूप में संदर्भित एक TILLING जनसंख्या में जीनोम में हुई. नीचे दिए गए सूत्र के आधार पर, यह पाया गया कि उत्परिवर्तन आवृत्ति के बारे में 1/690 kb की राशि.

Equation 1

Figure 1
चित्र 1: OsLCT1 (A, B) या SPDT (C) जीन में म्यूटेशन के लिए एम2 सीडिंग्स की एचआरएम-टिलिंग। जंगली प्रकार फ्लोरोसेंट अंतर घटता के विकास के लिए संदर्भ के रूप में चुना गया था. उत्परिवर्ती ों ने क्रमशः 90ण्0-92.0 डिग्री सेल्सियस तथा 81.5-83.5 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ख्थ् ब् ब् ब् ब् ब् ब् 005 के साथ काफी भिन्न एचआरएम वक्रों को दिखाया। यह आंकड़ा ली एट अल19से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: उत्परिवर्ती के लक्षित टुकड़े के Chromatograms अनुक्रमण. आयताकार बॉक्स एक विषमयुग्मज स्थल को इंगित करता है जिसमें ओएसएलसीटी1 ( ए ) के 4304 बीपी पर जी जेडए का उत्परिवर्तन हो जाताहै; OsLCT1 के 4240 बीपी पर एक एकल न्यूक्लिओटाइड एक प्रविष्टि एक तीर द्वारा इंगित किया गया है (बी; और एसपीडीटी के 5948-5950 बीपी की स्थिति में टीटीसी ट्राइन्यूक्लिओटाइड विलोपन एक काली रेखा (सी) द्वारा इंगित किया गया है। यह आंकड़ा ली एट अल19से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

संक्षिप्तिकरण पूरा नाम लाभ या प्रयोज्यता नुकसान संदर्भ
पारंपरिक टिलरिंग जीनोम्स में स्थानीय Lesions प्रेरित लक्ष्यीकरण स्क्रीनिंग बिंदु उत्परिवर्तनों के लिए समय और लागत खपत McCallum एट अल., 2000; एट अल तक, 2003
पारिस्थितिकी-लिंग इकोटाइप-टिलिंग प्राकृतिक आबादी में स्क्रीनिंग उत्परिवर्तनों के लिए महंगा और कम संवेदनशीलता कोमाई एट अल., 2004
डी-लिंग हटाना TILLING बड़े विलोपन स्क्रीनिंग के लिए अच्छा पीसीआर प्रणाली पर दृढ़ता से निर्भर करता है रोजर्स एट अल., 2009
iTILLING व्यक्तिगत टिलरिंग व्यक्तिगत TIILLING आबादी का उपयोग कर उत्परिवर्तनों की पहचान स्थायी जनसंख्या नहीं बुश और Krysan, 2010
DHPLC-TILLING उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी -आधारित टिलरिंग denaturing समय की बचत कम थ्रूपुट कोलासूनो एट अल., 2016
सेक-टिलिंग अनुक्रमण द्वारा टिलरिंग उच्च थ्रूपुट, गैर एंजाइमी प्रणाली अपेक्षाकृत महंगा और उच्च झूठी सकारात्मक Tsai एट अल., 2011; कुमार एट अल., 2017
एचआरएम-टिलरिंग उच्च संकल्प पिघलने-TILING उच्च थ्रूपुट और समय की बचत; गैर एंजाइमी प्रणाली पीसीआर टुकड़ा लंबाई की सीमा दांग एट अल., 2009; गादी एट अल., 2009

तालिका 1: विभिन्न TILLING दृष्टिकोण के फायदे और नुकसान.

जीन नाम जीन लोसी जीन समारोह प्राइमर अनुक्रम (5'-3') ऑप्टिमाइज़ेशन के बाद Tm (जेडसी) उत्पाद का आकार (बीपी) म्यूटेशन की संख्या (Mutation प्रकार)
OsLCT1 एलओसी06g38120 कम कैडमियम ट्रांसपोर्टर LCT-F: CTCGATGTAGCATGCTCC LCT-R: AGAGTCAGGACGGCTAC 61 195 2 (जी-एक संक्रमण, 1-बीपी प्रविष्टि)
एसपीडीटी एलओसी06g05160 SULTR की तरह फास्फोरस वितरण ट्रांसपोर्टर एसपीडीटी-एफ: टीटीसीजीजीजीजीसीटीएटी एसपीडीटी-आर: सीसीसीजीसीटीटीजीटीकैट 52 259 1 (3-बीपी विलोपन)

तालिका 2: दो लक्ष्य जीन, पीसीआर प्रवर्धन और उत्परिवर्तनों की जानकारी की पहचान की.

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Discussion

TILLING जीन कार्यात्मक विश्लेषण और फसल प्रजनन के लिए प्रेरित उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली रिवर्स आनुवंशिक उपकरण साबित हुआ है. कुछ लक्षण आसानी से मनाया या निर्धारित नहीं के लिए, उच्च throughput पीसीआर आधारित उत्परिवर्तन का पता लगाने के साथ TILLING विभिन्न जीन के लिए उत्परिवर्ती प्राप्त करने के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है. एचआरएम-टिलिंग विधि का उपयोग टमाटरकीईएमएस-म्यूटेजेनीकृत आबादी में 12, गेहूं11 और अंगूर20 में उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग के लिए किया गया है। इस पेपर में, एक सरल और अधिक शक्तिशाली एचआरएम-टिलिंग का प्रदर्शन किया गया था, जो इंडेल और एसबीएस उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग दोनों के लिए लागू होता है।

दक्षता में सुधार करने के लिए, DNAs SSF विधि के बजाय नियमित CTAB विधि है, जो समय और श्रम लेने वाली है और विषाक्त रासायनिक एजेंटों की आवश्यकता का उपयोग कर निकाले गए थे. Si एट अल21 SSF और CTAB विधि का उपयोग कर निकाले डीएनए की गुणवत्ता की तुलना में. यद्यपि यह पाया गया कि एसएसएफ निष्कर्षण से डीएनए में सीटीएब निष्कर्षण की शुद्धता कम थी, यह पीसीआर की आवश्यकताओं को पूरा कर सकता था और चावल में एचआरएम विश्लेषण के लिए। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि SSF निष्कर्षण से डीएनए एक लंबे समय के लिए संग्रहीत नहीं किया जा सकता है, इसलिए यह एक स्थायी उत्परिवर्ती पुस्तकालय की स्थापना के लिए उपयुक्त नहीं है.

एक पिछले अध्ययन में, 1/8 उत्परिवर्ती डीएनए के साथ जमा नमूने दोनों ईएमएस और गामा mutagenized आबादी14,19में एचआरएम विश्लेषण द्वारा जंगली प्रकार से भेदभाव किया जा सकता है . एम2 पौधों को ध्यान में रखते हुए प्रेरित उत्परिवर्तनों के लिए विषमयुग्मज हो सकता है, एचआरएम-लिंग द्वारा उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए चार एम2 संयंत्रों के पूलिंग की सिफारिश की गई थी।

अधिक म्यूटेंट प्राप्त करने के लिए, यह भी एक उच्च उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ mutagenized आबादी को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है. गामा किरणों का एम1 पौधों के विकास पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा। यह सूचित किया गया है कि उच्च खुराक के साथ उपचार के परिणामस्वरूप क्लोरोफिल की कमी वाले म्यूटेंट की आवृत्ति में वृद्धि हुई और एम2 पौधों18में प्रजनन क्षमता, बीज सेट और पौधों की ऊंचाई कम हो गई . इसके अलावा, यह ज्ञात था कि mutagens के लिए सहिष्णुता विभिन्न प्रजातियों के बीच विभिन्न. इसलिए, एम1 पौधों में लगभग 50% घातकता (LD50) के परिणामस्वरूप खुराक को इष्टतम विकिरण खुराक के रूप में माना जाता था। हालांकि, ली एट अल पाया विभिन्न उत्परिवर्तन खुराक (165, 246 और 389 Gy) resequencing द्वारा पूरे जीनोम में इसी तरह उत्परिवर्तन दरों में हुई, जो एक कम खुराक निहित उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है22.

इस पत्र में गामा प्रेरित पौधों के उत्परिवर्तन के लिए एचआरएम-टिलिंग का उदाहरण दिखाया गया है। इस पेपर में वर्णित एचआरएम-टिलिंग ईएमएस-म्यूटाजेनीकृत आबादी में स्क्रीनिंग उत्परिवर्तनों के लिए भी लागू होना चाहिए।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (सं. 2016YFD0102103) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (No.31701394) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2× Taq plus PCR Master Mix Tiangen, China KT201 PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate Bio-rad, America MSP-9651 Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus Eppendorf, German 6333000073 PCR amplification
LightScanner Idaho Technology, USA LCSN-ASY-0011 For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0 Idaho Technology, USA For analysis of the fluorescence change
EvaGreen Biotium, USA 31000-T Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000 Thermo Scientific, USA ND2000 For DNA quantification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
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आनुवंशिकी अंक 151 उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण एचआरएम टिलरिंग उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग इंडेल और एसबीएस गामा किरणों चावल
चावल की एक लिंग आबादी में पिघल उच्च संकल्प द्वारा उत्परिवर्तनों की पहचान
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Li, S., Yu, Y. P., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice. J. Vis. Exp. (151), e59960, doi:10.3791/59960 (2019).

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