皮质醇从鱼翅和爪骨基质提取
Summary
在这项研究中，我们提出了从鱼翅和下颌骨中提取皮质醇的规程。通过比较两种洗涤溶剂，然后进行ELISA测定，进一步检查了鳍和颌骨皮质醇水平。这项研究试验了颌骨皮质醇作为一种新的应激指标的可行性。
Abstract
本研究的目的是开发一种利用两种洗涤溶剂（水和异丙醇）从鱼翅中提取皮质醇的技术，并量化三种主要鱼种在鳍皮质醇水平上的任何差异。鱼翅是从19只牺牲的鱼中收获的，包括7只贝卢加（胡索胡索）、7只西伯利亚（阿西彭塞·贝尔里）和5只塞夫鲁加（A.斯特拉图斯）。在伊朗农场饲养了2年（2017-2018年），在韩国进行了皮质醇提取分析（2019年1月至2月）。五个H.Huso的爪骨也被用于皮质醇提取。在SAS环境中使用一般线性模型（GLM）过程对数据进行了分析。变异的测定内系数和相互变化系数分别为14.15和7.70。简而言之，皮质醇萃取技术涉及用3mL溶剂（超纯水和异丙醇）清洗样品（300~10mg），在80rpm下旋转2.5分钟，在室温（22-28°C）下对洗涤样品进行7天的空气干燥，进一步干燥样品在50 Hz下使用珠打手32分钟，将其研磨成粉末，将1.5mL甲醇涂在干粉（75~5mg）上，在室温下缓慢旋转（40rpm），持续搅拌18小时。提取后，对样品进行离心（9，500 x g，10分钟），将1mL上清液转移到新的微离心管（1.5 mL），在38°C孵育以蒸发甲醇，并通过酶连结免疫吸油测定（ELISA）进行分析.在鱼翅皮质醇水平方面，在洗涤溶剂之间，在鳍和下颌骨皮质醇水平方面没有观察到差异。这项研究的结果表明，鱼尾骨基质是固体基质的一个有前途的替代应力指标。
Introduction
皮质醇是动物压力的可靠指标。皮质醇提取为研究人员提供了一个有效的框架，以监测压力水平和压力源的一般模式。例如，以前的研究已经进行了方法验证头发皮质醇测量使用各种方法在人类1，2，猴子3，4，牛5，绵羊6，和金鱼7，8。在鱼类物种中，基质（如鳞片、皮肤粘液、粪便和血液）中的皮质醇测量显示，可以提供有关鱼类健康的信息。当血液取样有问题或缺乏鳞片时，需要替代皮质醇提取基质。在鱼类中，替代基质可以包括下颌骨，一种类似于人类牙齿10的硬组织。
开发新的基质和经过验证的技术来确定鱼子酱的应力水平是特别感兴趣的鱼子酱行业，在那里鱼子酱可能经历长期暴露于环境压力因素11。在2岁之前不能确定鱼群的性别，而且鱼没有鳞片。由于皮质醇在生长阶段2、7、12期间逐渐积累在固体基质中，因此来自硬质质质质质基（如鳍和颌骨）的长期皮质醇积累数据可以提供对应力的洞察处于不同生长阶段的水平。相比之下，血液皮质醇水平提供死亡时压力水平的快照，不能准确表示长期饲养条件下的压力13，14。随着鱼子酱市场竞争的日益激烈，在长期饲养（8-12年或更长时间）期间改善鱼苗品种生产更健康鸡蛋的压力条件的新方法日益成为一个日益重要的研究领域。由于鱼的昂贵成本，收获的样品非常昂贵（根据物种和生长阶段，每条成熟鱼8，000-15，000美元），这是研究项目的一个限制因素。然而，从鱼翅和颌骨中提取皮质醇的适当技术可以应用于养鱼系统和野生鱼类，以提高食用和食用的鱼卵的质量和收获保护。
除了提供可靠的结果6之外，选择适当的皮质醇提取技术对于确保样品制备过程中基质中存在的其他化合物不会混淆输出至关重要，这可能导致结果不一致。同样重要的是，确定鳍和颌骨皮质醇水平是否受周围水中的激素水平影响。Heimbürge等人15日提出，许多因素可能影响皮质醇水平，包括年龄、性别、怀孕、季节、颜色12和提取皮质醇的人体区域。然而，关于洗涤溶剂对鱼体基质8中皮质醇提取的影响，除了鱼卵17外，对鱼类的这些影响没有一点。
虽然分析来自鱼鳍和下颌骨的基线皮质醇水平需要对鱼进行安乐死，但这种方法并不涉及活鱼的血液取样所需的侵入性技术。鱼翅和颌骨样本很容易收集，并且可以从这些组织快速提取。同样，激素提取和分析是直接的，需要很少的专用设备。
在这项研究中，我们提出了一种新的、易于应用的技术，用于从鱼翅和颌骨中提取、洗涤和测定皮质醇，目的是确定从这些基质中测量的皮质醇水平是否可以可靠地用作应力指标。该技术的优点包括简单无创的8方法，更少的数据变异，和可靠的输出1，6，8，17;该技术适用于没有鳞片的鱼种，如鱼鳞。该技术需要屠宰鱼，选择适当的洗涤溶剂2，4，适当研磨样品3，5，专业酶链接免疫吸附测定（ELISA）应用5，7，并广泛了解皮质醇源纳入固体基质6。
我们应用了两种不同的洗涤溶剂（超纯水和异丙醇），从三种鱼翅中获得基底皮质醇水平：贝卢加（胡索胡索）、西伯利亚（阿西彭塞·贝尔里）和塞夫鲁加（A.斯特拉图斯）），在每个物种的标准环境条件下。H. huso的骨骼也被用来评估在鱼的应力。这是首次测量鱼尾骨皮质醇水平的研究。这项研究的结果将为在性别测定前的早期生长阶段（+1年）的鱼种提供比较皮质醇数据。
Protocol
Representative Results
Discussion
鱼儿有时被称为”活化石”，因为它在过去几千年里很少表现出适应。鱼子酱属含有27种鱼子酱;然而，三个物种（贝卢加、贝里和塞夫鲁加）生产了全球大部分鱼子酱。鱼种容易受到过度捕捞和自然栖息地的干扰，因此比其他任何物种群体都更加濒危。鱼是现存最古老的脊椎动物，已有1.5亿年的历史。物种成熟，生长缓慢;一些（例如，H.huso）可以活100年，体重超过2000公斤。鱼是…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是在农业科学和技术发展合作研究方案的支持下进行的（项目标题：牲畜生产力变化与气候变化分析，项目No.PJ012771），农村发展管理局，大韩民国。此外，这项研究也得到了赠款的支持（第1号。PJ01344604）来自韩国首尔国立动物科学研究所动物营养与生理学团队。作者感激地感谢波斯手势首席执行官穆罕默德·哈桑·萨勒曼扎德和他的团队，他们提供了在这项研究中所检查的三种鱼种的鱼。
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
Referências
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