आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करके परिपत्र आरएनए की पहचान
Summary
परिपत्र आरएनए (सर्क्रैना) गैर-कोडिंग आरएनए हैं जिनमें प्रोटीन के बीच प्रतिलेखन विनियमन और मध्यस्थता बातचीत में भूमिकाएं हो सकती हैं। सर्आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों के निर्माण के लिए विभिन्न मापदंडों के मूल्यांकन के बाद, एक प्रोटोकॉल RNase आर पूर्व उपचार के साथ फंसे कुल आरएनए पुस्तकालय की तैयारी का उपयोग संकलित किया गया था और यहां प्रस्तुत किया जाता है ।
Abstract
सर्कुलर आरएनए (सर्क्रैना) माइक्रो-आरएनए (मिरना) नियमन, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की मध्यस्थता और माता-पिता के जीन ट्रांसक्रिप्शन के नियमन सहित कार्यों में शामिल गैर-कोडिंग आरएनए का एक वर्ग है। शास्त्रीय अगली पीढ़ी आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) में, सिरआरएनए को आमतौर पर एमआरएनए पुस्तकालयों के निर्माण के दौरान पॉली-ए चयन के परिणामस्वरूप अनदेखा किया जाता है, या बहुत कम बहुतायत में पाया जाता है, और इसलिए अलग-थलग और पता लगाना मुश्किल होता है। यहां, पुस्तकालय तैयार करने की किट, पूर्व उपचार विकल्प और विभिन्न कुल आरएनए इनपुट राशि की तुलना करके एक सिरआरएनए पुस्तकालय निर्माण प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था। दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरे ट्रांसक्रिप्टोम लाइब्रेरी तैयारकरने किट, के साथ और RNase आर पूर्व उपचार के बिना, और कुल आरएनए इनपुट (1 से 4 μg) की चर मात्रा का उपयोग कर, परीक्षण किया गया । अंत में, कई ऊतक प्रकार; जिगर, फेफड़े, लिम्फ नोड, और अग्न्याशय सहित; साथ ही कई मस्तिष्क क्षेत्रों; जिसमें सेरिबैलम, अवर पार्श्व पालि, मध्यम लौकिक जायरस, ऑक्सीपिटल कॉर्टेक्स, और बेहतर ललाट जाइरस शामिल हैं; ऊतक प्रकारों में सिरआरएनए बहुतायत का मूल्यांकन करने के लिए तुलना की गई थी। छह अलग-अलग सिरआरएनए डिटेक्शन टूल (find_circ, सीआईआई, मैप्सप्लिस, नाइफ, डीसीसी और सीआईआरसीएक्सप्लोरर) का उपयोग करके उत्पन्न आरएनए-सीक्यू डेटा के विश्लेषण से पता चला कि आरएनसे आर प्री-ट्रीटमेंट और 4ग्राम आरएनए इनपुट के साथ एक फंसे कुल आरएनए लाइब्रेरी तैयारकरने किट इष्टतम है सर्क्रैना की उच्चतम सापेक्ष संख्या की पहचान करने के लिए विधि। पिछले निष्कर्षों के अनुरूप, अन्य ऊतक प्रकारों की तुलना में मस्तिष्क के ऊतकों में सर्केना का उच्चतम संवर्धन देखा गया था।
Introduction
परिपत्र आरएनए (सीआईआरसीआरएनए) एंडोजेनस, नॉन-कोडिंग आरएनए हैं जिन्होंने यूकेरियोटिक ट्रांसक्रिप्टोम1,2,3में अपनी व्यापक अभिव्यक्ति को देखते हुए ध्यान प्राप्त किया है। वे तब बनते हैं जब एक-दूसरे को वापस-स्प्लिस करते हैं और इसलिए शुरू में4,5की कलाकृतियां स्प्लिसिंग मानी जाती थीं । हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सर्क्रैना सेल प्रकार, ऊतक और विकासात्मक चरण विशिष्ट अभिव्यक्ति3,6 प्रदर्शित करते हैं और विकासवादी रूप से संरक्षितहैं 2,3। इसके अलावा, वे प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन7,माइक्रो-आरएनए (मिरना) बाध्यकारी3,8,9,10और माता-पिता के जीन ट्रांसक्रिप्शन11के नियमन की मध्यस्थता में शामिल हैं।
शास्त्रीय आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) में, एमआरएनआरए के लिए पॉली-ए चयन के परिणामस्वरूप पुस्तकालय निर्माण के दौरान सिरक्रैना पूरी तरह से खो सकता है या उनकी कम बहुतायत को देखते हुए अलग करना मुश्किल हो सकता है। हालांकि, हाल ही में सर्आरएनए लक्षण वर्णन अध्ययनों ने RNase आर का उपयोग करके एक पूर्व-उपचार कदम को शामिल किया है ताकि सर्कराना2,12,13के लिए समृद्ध किया जा सके। RNase R एक एक्सोरिजोन्यूकलीज है जो रैलियक आरएनए को पचाता है, जो परिपत्र आरएनए संरचनाओं को पीछे छोड़ता है। सिरआरएनए संवर्धन प्रोटोकॉल को दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरे ट्रांसपेटोम लाइब्रेरी निर्माण किट से डेटा उत्पन्न करने और तुलना करके अनुकूलित किया गया था, साथ और बिना एक RNase आर पूर्व उपचार चरण के बिना, और कुल आरएनए इनपुट (1 से 4 ग्राम) की अलग-अलग मात्रा का उपयोग करके। अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग अगले पांच विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों (सेरिबैलम [ईसा पूर्व], अवर पार्श्व पालि [आईपी], मध्य लौकिक जायरस [एमजी], ऑक्सीपिटल कॉर्टेक्स [ओसी] और बेहतर ललाट जाइरस [एसएफ]) और चार अन्य ऊतक प्रकारों (जिगर [एलवी], फेफड़े [एलयू], लिम्फ नोड [एलएन] और अग्न्याशय [पीए]) में सिरिआरएनए की बहुतायत का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था । आरएनए-सीक्यू पुस्तकालयों को अंतिम अनुक्रमित जोड़ा गया और डेटा का विश्लेषण छह अलग-अलग सर्आरएनए भविष्यवाणी एल्गोरिदम का उपयोग करके किया गया: find_circ3,सीआईआरआई14,मैप्सप्लिस15,चाकू16,डीसीसी17और सीआईआरसीएक्सप्लोरर18। हमारे विश्लेषण के आधार पर, रैनसे आर प्री-ट्रीटमेंट और 4 μg कुल इनपुट आरएनए के साथ एक फंसे कुल आरएनए लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करते समय अद्वितीय सर्करनास की उच्चतम संख्या का पता लगाया गया था। अनुकूलित प्रोटोकॉल यहां वर्णित है। जैसा कि पहले19,20की रिपोर्ट थी, अन्य ऊतक प्रकारों की तुलना में मस्तिष्क में सिरक्रैना का उच्चतम संवर्धन देखा गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, सिरआरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों के निर्माण के लिए एक सर्आरएनए संवर्धन प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालय तैयारकरने किट, पूर्व-उपचार विकल्प, और इनपुट…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मानव मस्तिष्क ऊतकों के प्रावधान के लिए सूर्य शहर, एरिजोना के बैनर सूर्य स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान मस्तिष्क और शरीर दान कार्यक्रम (BBDP) के लिए आभारी हैं । BBDP को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डरएंड स्ट्रोक (पार्किंसंस डिजीज एंड संबंधित विकारों के लिए U24 NS072026 नेशनल ब्रेन एंड टिश्यू रिसोर्स), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (P30AG19610 एरिजोना अल्जाइमर डिजीज कोर सेंटर), एरिजोना डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ सर्विसेज (कॉन्ट्रैक्ट 211002, एरिजोना अल्जाइमर अनुसंधान केंद्र), एरिजोना जैव चिकित्सा अनुसंधान आयोग (अनुबंध ४००१, 0011, 05-901 और १००१ एरिजोना पार्किंसंस रोग कंसोर्टियम के लिए) और माइकल जे । पार्किंसंस रिसर्च27के लिए फॉक्स फाउंडेशन । इस अध्ययन को डीएचएस और एरिजोना राज्य (एडीएचएस अनुदान # ADHS14-052688) द्वारा भी समर्थित किया गया था। हम प्रशासनिक सहायता के लिए एंड्रिया श्मिट (बैनर रिसर्च) और सिंथिया लेचुगा (टीजेन) को भी धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
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