원형 RNA (circRNAs)는 단백질 사이 전사 규칙 그리고 중재 상호 작용에 있는 역할을 할 수 있는 비 코딩 RNA입니다. circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 구성을 위한 상이한 파라미터의 평가에 이어, RNase R 전처리와 함께 좌초된 총 RNA 라이브러리 제제를 활용한 프로토콜이 컴파일되고 여기에 제시된다.
원형 RNA (circRNAs)는 마이크로 RNA (miRNA) 규정, 단백질 상호 작용의 중재 및 부모 유전자 전사의 조절을 포함하는 기능에 관여하는 비 코딩 RNA의 부류입니다. 고전적인 차세대 RNA 염기서열 분석(RNA-seq)에서 circRNAs는 전형적으로 mRNA 라이브러리의 시공 동안 폴리-A 선택의 결과로 간과되거나 매우 낮은 풍부함에서 발견되며, 따라서 분리 및 검출하기 가 어렵습니다. 여기서, circRNA 라이브러리 시공 프로토콜은 라이브러리 제제 키트, 전처리 옵션 및 다양한 총 RNA 입력 량을 비교하여 최적화되었다. RNase R 전처리 및 가변 적인 양의 총 RNA 입력(1~ 4 μg)을 사용 하 여 2 개의 시판 된 전체 전사체 라이브러리 준비 키트를 테스트 했습니다. 마지막으로, 여러 조직 유형; 간을 포함 하 여, 폐, 림프절, 그리고 췌 장; 뿐만 아니라 여러 뇌 영역; 소뇌, 열등한 정수리 엽, 중간 측두엽, 후두 피질 및 우수한 전두엽 자이러스를 포함; 조직 모형에 걸쳐 circRNA 풍부를 평가하기 위하여 비교되었습니다. 6개의 서로 다른 circRNA 검출 도구(find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC 및 CIRCexplorer)를 사용하여 생성된 RNA-seq 데이터를 분석한 결과 RNase R 전처리 및 4 μg RNA 입력을 사용한 총 RNA 라이브러리 준비 키트가 최적임을 밝혀냈습니다. circRNAs의 가장 높은 상대 수를 식별하는 방법. 이전 사실 인정과 일치, circRNAs의 가장 높은 농축 다른 조직 유형에 비해 뇌 조직에서 관찰 되었다.
원형 RNA(CircRNAs)는 진핵 전사체1,2,3에서그들의 만연한 발현을 감안할 때 주목을 받고 있는 내인성, 비코딩 RNA이다. 그(것)들은 exons가 서로 에 다시 접합할 때 형성되고, 그러므로 처음에 접합유물4,5로여겨졌습니다 . 그러나, 최근 연구에 따르면 circRNAs는 세포 유형, 조직 및 발달 단계 특이적 발현3,6을 나타내고 진화적으로 보존되는2,3. 더욱이, 이들은 단백질-단백질 상호작용7,마이크로RNA(miRNA) 결합3,8,9,10,및 부모 유전자전사(11)의조절에 관여한다.
고전적인 RNA 염기서열 분석(RNA-seq)에서, circRNAs는 mRNA를 위한 폴리-A 선택의 결과로 라이브러리 시공 도중 완전히 손실될 수 있거나 그들의 낮은 풍부도를 감안할 때 격리하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 최근 circRNA 특성화 연구는 CircRNAs2,12,13을풍부하게 하기 위해 RNase R을 이용한 전처리 단계를 통합했다. RNase R은 선형 RNA를 소화하는 외분비증으로, 원형 RNA 구조를 남깁니다. CircRNA 농축 프로토콜은 RNase R 전처리 단계의 유무에 관계없이 시판되는 두 개의 전체 전사체 라이브러리 구성 키트에서 데이터를 생성 및 비교하고 다양한 양의 총 RNA 입력(1 ~ 4 μg)을 사용하여 최적화되었습니다. 최적화된 프로토콜은 5개의 상이한 뇌 영역(소뇌 [BC], 열등한 정수리 엽 [IP], 중간 측두엽 [MG], 후두 피질 [OC] 및 우수한 전두엽 자이러스 [SF]) 및 4개의 다른 조직 유형(간[LV], 폐[LU]] 및 파프린스 [LN]에 걸쳐 circRNAs의 풍부를 평가하는 데 사용되었다. RNA-seq 라이브러리는 짝을 이루고 데이터를 6개의 상이한 circRNA 예측 알고리즘을 사용하여 분석했다: find_circ3,CIRI14,Mapsplice15,나이프16,DCC17,및 CIRCexplorer18. 우리의 분석에 기초하여, RNase R 전처리 및 4 μg 총 입력 RNA를 가진 좌초된 총 RNA 라이브러리 준비 키트를 사용할 때 가장 많은 고유 circRNAs가 검출되었다. 최적화된 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이전에 보고 된 바와 같이19,20,circRNAs의 가장 높은 농축은 다른 조직 유형에 비해 뇌에서 관찰되었다.
본 연구에서, 시판되는 2개의 라이브러리 준비 키트, 전처리 옵션 및 입력 RNA 양은 circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 시공을 위한 circRNA 농축 프로토콜을 최적화하기 위해 시험되었다. 이 연구의 평가에 기초하여, circRNA 염기서열 분석 라이브러리를 만드는 중요한 단계및 중요한 단계의 숫자는 명백하다. 우리의 평가는 검출된 circRNAs의 증가수에 의해 반영되는 RNase R 전처리의 유용성을 확인합니?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 인간의 뇌 조직의 제공에 대한 선 시의 배너 태양 건강 연구소 뇌와 신체 기증 프로그램 (BBDP)에 감사드립니다. BBDP는 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (U24 NS072026 파킨슨 병 및 관련 장애에 대한 국가 뇌 및 조직 자원), 노화에 대한 국립 연구소 (P30AG19610 애리조나 알츠하이머 병 핵심 센터), 건강 서비스의 애리조나 부서 (계약 211002, 애리조나 알츠하이머 연구 센터), 애리조나 생물 의학 연구위원회 (계약 4001, 0011, 05-901 및 1001 애리조나 파킨슨 병 컨소시엄) 및 마이클 J. 파 킨 슨 병의 연구에 대 한 폭스 재단27. 이 연구는 또한 DHS와 애리조나 주 (ADHS 교부금 # ADHS14-052688)에 의해 지원되었다. 우리는 또한 안드레아 슈미트 (배너 연구)와 신시아 레슈가 (TGen) 행정 지원을 주셔서 감사합니다.
1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
TElowE | VWR | 10128-588 | |
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
Universal control RNA | Agilent | 740000 |