해리 된 기본 해 마 문화에서 조미료 수용 체 인신 매매를 연구 하는 항 체 먹이 접근
Summary
이 문서는 조미료 수용 체를 연구 하는 방법을 제시 (GluR) 해리 된 기본 해 마 문화에서 인신 매매. 약리학적 접근법과 함께 내인성 또는 과발현 수용체를 라벨링하는 항체 공급 접근법을 사용하여, 이 방법은 조절하여 GluR 표면 발현을 조절하는 분자 메커니즘의 식별을 허용합니다. 내재화 또는 재활용 프로세스.
Abstract
외부 자극에 대한 세포 반응은 주어진 순간에 세포 표면에서 발현되는 수용체 세트에 크게 의존합니다. 따라서, 표면 발현 수용체의 집단은 지속적으로 적응하고 엄격한 조절 메커니즘에 따라 달라질 수 있다. 생물학에서 가장 많이 연구된 인신매매 사건 중 하나인 패러다임의 예는 글루타메이트 수용체(GluRs)의 시냅스 발현을 조절하는 것이다. GluRs는 중추 신경계에서 흥분성의 신경 전달의 대부분을 중재하고 시냅스 및 뉴런 수준 (예를 들어, 시냅스 가소성)에서 생리 적 활성 의존적 인 기능 및 구조적 변화를 제어합니다. 표면 표현 GluRs의 수, 위치 및 소단위 조성에 있는 수정은 신경 기능에 깊이 영향을 미치고, 사실, 이 요인에 있는 변경은 다른 신경병증과 연관됩니다. 여기에 제시된 것은 해리된 해마 1차 뉴런에서 GluR 인신매매를 연구하는 방법이다. “항체 공급” 접근법은 표면 및 내부 막에서 발현된 GluR 집단을 차별화하기 위해 사용됩니다. 살아있는 세포에 표면 수용체를 표지하고 수용체 내균증 및 / 또는 재활용을 허용하기 위해 다른 시간에 고정함으로써, 이러한 인신 매매 과정을 평가하고 선택적으로 연구 할 수 있습니다. 이것은 GluR 인신 매매에 영향을 미치는 자극 및 분자 메커니즘에 대 한 귀중 한 정보를 얻기 위해 약리학 접근 또는 변경 된 수용 체의 과발현과 함께에서 사용할 수 있는 다양 한 프로토콜. 유사하게, 다른 수용체 또는 표면 발현 단백질을 연구하기 위해 용이하게 적응될 수 있다.
Introduction
세포는 특정 세포 국소화에 단백질을 동원하고 그들의 기능에 엄격한 spatiotemporal 규정을발휘하기 위하여 인신 매매의 적극적인 프로세스를 이용합니다 1. 이 과정은 다른 환경 자극에 세포 응답 수용 체 활성화에 의해 트리거 된 세포 내 캐스케이드에 의존 으로, 막 전 수용 체에 대 한 특히 중요 하다. 세포는 수용체 세포 인신 매매 조절을 통해 세포 표면에서 발현되는 수용체의 밀도, 국소화 및소단위 조성을 변경함으로써 이러한 반응을 수정할 수 있다 2. 플라즈마 막에 새로 합성 된 수용체의 삽입, 내분비증 및 기존 수용체의 재활용은 표면 발현 수용체의 순 풀을 결정하는 인신 매매 과정의 예2. 많은 분자 기계장치는 단백질 인산화, 유비퀴틴화, 또는 palmitoylation 2와 같은 단백질 단백질 상호 작용 및번역 후 수정을 포함하여 단백질 인신 매매를 통제하기 위하여 협력합니다.
수용체 인신 매매의 조절은 고도로 전문화된 구조물을 가진 강하게 편광된 세포에서 특히 요구됩니다. 패러다임의 예는 글루타메이트 수용체(GluRs)의 규제된 인신매매에 의한 뉴런 기능의 조절이다3,4. 조미료, 주요 흥분 성의 신경 전달 물질, 바인딩 및 시 냅 스 신경 전달 및 시 냅 스 가소성 등 기본적인 생리 신경 기능을 제어 하는 표면 표현 된 GluRs를 활성화. 변경된 GluR 인신 매매가 신경 발달 장애에서 신경 퇴행성 질환에 이르기까지 광범위한 신경 병증에서 관찰되었다는 사실은이 과정의 중요성을강조5. 따라서, GluR 인신 매매를 제어하는 분자 사건을 이해하는 것은 연구의 많은 분야에서 관심입니다.
이 프로토콜에서, 항체 공급 기반 방법은 1 차적인 해마 뉴런에서 표면 발현 글루스의 수준을 정량화하고 관찰된 순 표면 발현에서 내재화 및 재활용의 변화가 어떻게 초래되는지 평가하기 위해 사용된다. 특정 돌연변이를 품고 있는 외인성 수용체의 약리학 및/또는 과발현의 사용은 이 프로토콜이 다른 환경 자극에 근본적인 신경 적응을 기초로 하는 분자 기계장치를 공부하기 위한 특히 강력한 접근을 만듭니다. 이 프로토콜의 유용성의 마지막 예는 환경의 다단계 변화(예: 질병 모델)가 이러한 모델의 표면 발현 검사를 통해 GluR 인신 매매에 미치는 영향을 연구하는 것입니다.
특정 한 예를 사용 하 여, 그것은 처음에 생리 적 시 냅 스 자극을 모방 하는 약리학 조작 을 입증 [화학 LTP (cLTP)] 내 인 성 GluA1 소부의 표면 발현을 증가 하는 글러스 (AMPARs)의 6. NMDA 형 글루어 (NMDARs)의 GluN2B 하위 단위의 과발광 인광 모방 형태의 인신 매매는 또한이 프로토콜이 특정 번역 후 인신 매매의 규제를 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 예시하기 위해 분석됩니다. 수정. 이러한 특정 예가 사용되지만, 이 프로토콜은 항원 세포 외 도메인을 소유한 다른 GluRs 및 기타 수용체 및 단백질에 쉽게 적용될 수 있다. 세포외 도메인에 사용할 수 있는 항체가 없는 경우, 세포외 에피토프 태그(예를 들어, 플래그-, Myc-, GFP 태그 등)의 과발현단백질은 단백질 라벨링을 지원할 수 있다.
현재 프로토콜은 특정 GluR 아류형 밀도를 정량화하고 특정 항체를 사용하여 트래피킹을 위한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 1) 총 GluR 표면 발현, 2) GluR 내재화 및 3) GluR 재활용을 연구하는 데 이용될 수 있다. 각 과정을 개별적으로 연구하려면 섹션 1과 2로 시작하여 섹션 3, 4 또는 5를 계속하는 것이 좋습니다. 모든 경우에 6과 8절(그림1)으로 마칩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포와 그 환경 사이의 상호 작용 (예를 들어, 다른 세포와의 통신, 다른 자극에 대한 반응 등),은 세포 표면에서 수용체의 올바른 발현에 크게 의존합니다. 표면 발현 수용체 함량의 신속하고 미세 조정된 조절은 끊임없이 변화하는 환경에 대한 적절한 세포 반응을 가능하게 합니다. 뉴런의 경우, 합성적으로 발현된 수용체의 수, 국소화 및 소단위 조성의 변화는 시냅스 통신, 시냅스 가소성, 시냅?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Nikon A1 공초점 현미경의 사용과 실험 계획 및 분석에 있는 그들의 도움을 위한 고급 현미경 검사법에 대한 노스웨스턴 센터에 감사드립니다. 이 연구는 NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) 및 NIA (R00AG041225) 및 뇌 행동 연구 재단 (#24133)에서 NARSAD 젊은 조사자 보조금에 의해 지원되었다 (A. S. -C.).
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
Referências
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