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Neuroscience

CRISPR-Cas9 का उपयोग कर मधुमक् खी मस्तिष्क वर्गों में एंटी-आरडीएल और एंटी-mGlutR1 रिसेप्टर्स एंटीबॉडी परीक्षण

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/59993
Automatic Translation
1,2, *2, *2, 3, 2, 1, 4, 4, 2
1Department of Neuroscience, University of Arizona, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Department of Scientific and Technologic Investigations, University of Sonora, 4Integrated DNA Technologies, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत एंटीबॉडी विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए वयस्क मधुमक् खी मस्तिष्क में प्रोटीन के उत्पादन को कम करने के लिए CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है।

Abstract

क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR)/CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) एक जीन संपादन तकनीक है जो जीन फ़ंक्शन के अध्ययन में व्यापक रूप से उपयोग की जाती है। हम इस अध्ययन में इस विधि का उपयोग कीट गाबाए रिसेप्टर सबयूनिट प्रतिरोध के खिलाफ विकसित एंटीबॉडी की विशिष्टता की जांच करने के लिए करते हैं, जो डिएलड्रिन (आरडीएल) और एक मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर mGlutR1 (mGluRA) के खिलाफ विकसित किया गया है। एंटीबॉडी फल मक्खियों(ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर)के साथ-साथ मधुमक्खियों(एपीआईएस मेलिफेरा)के लिए विशिष्ट संयुग्मित पेप्टाइड्स के खिलाफ खरगोशों में उत्पन्न किए गए थे। हम मधुमक् खी मस्तिष्क वर्गों में इन एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया मधुमक् खी दिमाग में रिसेप्टर्स के वितरण का अध्ययन । एंटीबॉडी पेप्टाइड के खिलाफ शुद्ध थे और इम्यूनोब्लास्टिंग और पेप्टाइड कॉन्जुगेट्स के साथ प्रेक्टोप्शन की शास्त्रीय विधि के साथ परीक्षण किया गया था ताकि यह दिखाया जा सके कि एंटीबॉडी इसी पेप्टाइड कॉन्जुगेट्स के लिए विशिष्ट हैं जिसके खिलाफ उन्हें उठाया गया था। यहां हमने इसी रिसेप्टर के लिए डिजाइन किए गए गाइड आरएनए के साथ CRISPR-Cas9 इंजेक्शन के बाद मस्तिष्क 48 एच में प्रोटीन लक्ष्यों की कमी के लिए परीक्षण करने के लिए CRISPR-Cas9 तकनीक विकसित की। CRISPR-Cas9 विधि भी वयस्क मधुमक्खियों में व्यवहार विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है जब एक या कई जीन को संशोधित करने की जरूरत है ।

Introduction

हाल ही में खोजे गए CRISPR/Cas9 प्रणाली एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग विभिन्न मॉडल प्रणालियों और जीवों में जीनोमिक डीएनए को बदलने के लिए किया गया है । इसने जीनोम संशोधन को पिछले तरीकों की तुलना में अधिक कुशल और मजबूत बनाकर जैव चिकित्सा अनुसंधान और प्रमुख तकनीकी सफलताओं को तेज कियाहै। एस पायोजीन बैक्टीरिया के मूल निवासी, सिस्टम एक Cas9 एंनोटुकलीज पर निर्भर करता है, जिसकी गतिविधि डीएनए में डबल-फंसे ब्रेक (डीएसबी) की ओर जाता है, और एक गाइड आरएनए (gRNA) जो Cas9 प्रोटीन को एक विशिष्ट, अनुक्रम-निर्भर स्थान2पर निर्देशित करता है। CRISPR/Cas9 द्वारा उत्पन्न डबल-फंसे ब्रेक को गैर-अाहचार अंत में शामिल होने (NHEJ) के माध्यम से मरम्मत की जा सकती है, एक त्रुटि-प्रवण प्रक्रिया जो एक दाता टेम्पलेट मौजूद होने पर फ्रेमशिफ्ट, या होमोलॉजी सीधी मरम्मत का कारण बन सकती है । एसआरएनए में ही एक लक्ष्य-विशिष्ट CRISPR आरएनए (crRNA) और एक सार्वभौमिक ट्रांस-एक्टिविंग क्रैना (ट्रेसरना) शामिल है जिसे रासायनिक रूप से संश्लेषित किया जा सकता है और एक रिपोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (आरएनपी)2,3के रूप में शुद्ध कै9 न्यूकलीज के साथ वितरित किया जा सकता है। ग्रेनए या कै9 न्यूकलीज की फ्लोरोसेंट लेबलिंग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी4के माध्यम से आणविक घटकों का पता लगाने और इंट्रासेलर दृश्य के लिए अनुमति दे सकती है।

हमारे वर्तमान कार्य में, हम वयस्क मधुमक् खी दिमाग में प्रोटीन के स्तर को कम करने के लिए CRISPR-Cas9 प्रणाली का लाभ उठाते हैं। हमने मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर (mGluR) और एंटी-mGlutR1 रिसेप्टर एंटीबॉडी और गाबाए रिसेप्टर सबयूनिट आरडीएल और एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी का अध्ययन किया। हमने वयस्क मधुमक् खी के मस्तिष्क में प्रोटीन की मात्रा को कम करने के लिए एक सरल विधि विकसित की और इसका उपयोग संबंधित प्रोटीन के खिलाफ विकसित एंटीबॉडी के अतिरिक्त परीक्षणों को चलाने के लिए किया। CRISPR-Cas9 के फ्लोरेसेंस की निगरानी ने हमें प्रोटीन की कमी में शामिल क्षेत्रों और कोशिकाओं का अनुमान लगाने की अनुमति दी ।

इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी की भी विशेषता है जो खरगोशों में संयुग्मित पेप्टाइड के खिलाफ बनाए गए थे। मधुमक् खी जीनोम एक अत्यधिक संरक्षित AmgluRA (NCBI नामकरण के अनुसार mGlutR1 नाम) मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर5एनकोड करता है। हनीबी mGlutR1 जीन NCBI डाटाबेस के अनुसार चार भविष्यवाणी की स्प्लिस वेरिएंट है । यह बताया गया है कि यह प्यूपल और वयस्क मधुमक्खी दोनों चरणों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में व्यक्त किया जाता है और यह दीर्घकालिक स्मृति गठन5में शामिल है। mGlutR1 के खिलाफ विकसित एंटीबॉडी मधुमक्खियों में सीखने और स्मृति प्रक्रिया में ग्लूटामर्गिक प्रणाली का अध्ययन करने के लिए एक आवश्यक उपकरण हो सकता है।

हमारे अध्ययनों में, हमने एपिस् मेलिफेरा आरडीएल रिसेप्टर उपइकान से संयुग्मित पेप्टाइड्स के साथ प्रतिरक्षित खरगोशों में विकसित एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी की भी विशेषता है। मधुमक् खी Rdl जीन, AmRdl (XM_006565102.3, NCBI डाटाबेस), 14 स्प्लिस वेरिएंट की भविष्यवाणी की है। एनसीबीआई डाटाबेस AF094822.1 में आंशिक रूप से क्लोन किए गए टुकड़े की सूचना मिली है। आरडीएल रिसेप्टर फंक्शन और इसके फिजियोलॉजी का अच्छी तरह से अध्ययन कीड़ोंमें 6,7,8, मधुमक्खियोंसहित 9,10,11. एंटी-आरडीएल के खिलाफ विकसित एंटीबॉडी मधुमक्खियों में सीखने और स्मृति प्रक्रिया में गैबाएर्गिक प्रणाली का अध्ययन करने के लिए एक आवश्यक उपकरण हो सकता है।

ऑक्टोपामाइन और टायरामीन रिसेप्टर्स की भूमिका पर एक पूर्व अध्ययन में मस्तिष्क में इंजेक्शन दिया गया था , जिसके बाद पश्चिमी दाग12,13द्वारा प्रोटीन की मात्रा का परीक्षण किया गया था । हालांकि, आरएनएआई की कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। आरएनएआई इंजेक्शन के बाद केवल एक कम समय की खिड़की होती है जिसके भीतर प्रोटीन की कमी होती है13. CRISPR-Cas9 हाल ही में मधुमक् खी भ्रूण में इस्तेमाल किया गया था को नष्ट करने या पूरे पशु14,15,16में जीन को संशोधित । हमने वयस्क मधुमक् खी में प्रोटीन की मात्रा को कम करने के लिए CRISPR-Cas9 के उपयोग की सूचना दी। हमने मधुमक्खियों के लिए यह दृष्टिकोण विकसित किया क्योंकि यह नियंत्रित प्रयोगशाला स्थितियों17के तहत सीखने और स्मृति के व्यवहार अध्ययन के लिए इसे जोड़े रखने की क्षमता है ।

वर्तमान काम में, हमने दो रिसेप्टर्स के खिलाफ एंटीबॉडी विकसित की और प्रोटीन CRISPR-Cas9 इंजेक्शन द्वारा कम होने के बाद वयस्क मधुमक्खी मस्तिष्क वर्गों पर उनका परीक्षण किया। साथ ही, हमने एक प्रयोगात्मक डिजाइन की स्थापना की जो व्यवहार प्रयोगों के लिए विधि के उपयोग की अनुमति देता है।

Protocol

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एरिजोना स्टेट यूनिवर्सिटी के एनिमल केयर गाइडलाइंस का पालन करता है ।

1. एपीआईएस मेलिफेरा के दिमाग से कुल प्रोटीन अलगाव

नोट: इस प्रयोग के लिए अज्ञात उम्र के एपिस मेलिफेरा नई दुनिया कार्निओलन फोरेजर्स का उपयोग करें।

  1. जालसाज मधुमक्खियों17पर कब्जा करने के लिए छत्ते के प्रवेश द्वार पर एक एल्यूमीनियम जाल स्क्रीन रखें । प्रत्येक टोपी में एक छोटे से छेद के साथ एक शीशी में प्रत्येक मधुमक्खी पर कब्जा। मधुमक्खियों से युक्त शीशियों को बर्फ में रखें ताकि उनके शरीर का तापमान कम हो सके और उन्हें स्थिर किया जा सके। मधुमक्खियों को बर्फ में 3 से अधिक नहीं के लिए छोड़ दें।
  2. पहले से तैयार धातु धारकों में स्थिर मधुमक्खियों को सुरक्षित करें। सुनिश्चित करें कि धातु धारकों का निर्माण किया जाता है ताकि मधुमक्खी को डक्ट टेप के छोटे टुकड़ों के साथ सुरक्षित किया जा सके, लेकिन फिर भी इसकी पीठ छाती, पंख और सिर उजागर होता है।
    सावधानी: सुनिश्चित करें कि मधुमक्खियों को धारकों में रखने के प्रयास से पहले पूरी तरह से स्थिर हैं।
  3. मधुमक्खियों को 5 मीटर सिरिंज का उपयोग करके 1 एम सुक्रोज समाधान के साथ खिलाएं जब तक कि वे अब भूखे न हों। सुरक्षित मधुमक्खियों को एक गीले कागज तौलिया के साथ एक बॉक्स में रखें ताकि आर्द्र वातावरण सुनिश्चित किया जा सके।
  4. बैराक्वेर आइरिस कैंची (सामग्री की तालिका देखें) के साथ सिर काटकर मधुमक्खी के मस्तिष्क को तेजी से काटना (सामग्री की तालिकादेखें) और सामने से सिर खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  5. सिर कैप्सूल से मस्तिष्क को काट लें, मस्तिष्क को #5 संदंश के साथ लें, और इसे ठंड के 100 माइक्रोन (4-8 डिग्री सेल्सियस) लिसिस बफर में रखें। लिसिस बफर में 120 एमएम ट्रिस-एचसीएल होते हैं, 2% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडी), 5% ग्लाइसेरोल, 0.2 एमएम डिथिओथ्रिटॉल, 1% ट्राइटन एक्स-100, और प्रोटीज अवरोधक पीएमएसएफ (फिनाइलमेथिलसल्फोनिलफ्लोराइड), एप्रोटिनिन, बेंजामाडिन (पीएच.8) लगभग 2 मिन के लिए मूसल में बदलकर लाइसेस समाधान में मस्तिष्क को समरूप करें।
  6. 20 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर नमूना अपकेंद्रित ्रित करता है।
  7. फ्लोरीमीटर का उपयोग करके कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए सुपरनेटेंट का 1 माइक्रोन लें। कुल प्रोटीन की अनुमानित एकाग्रता प्रति मधुमक्खी 2-3 मिलीग्राम/मीटर के बीच थी । अधिनेता का 10 माइक्रोन लें और लाइसिस बफर के 10 माइक्रोन और 6x लैमली बफर18के 10 माइक्रोन जोड़ें । संक्षेप में स्पिन करें और 3 मिन के लिए उबालें, फिर बर्फ पर ठंडा करें। सभी मलबे को हटाने के लिए 10,000 x ग्राम पर 1 मिन के लिए स्पिन करें। मधुमक्खी मस्तिष्क के दसवें हिस्से में कुल प्रोटीन का लगभग 25 एनजी होता है।

2. वेस्टर्न ब्लॉटिंग19

  1. अल्ट्राप्योर आसुत पानी के 12.15 मिलील युक्त 10% रनिंग जेल का 30 मीटर बनाएं, 1.5 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.8), 10% एसडीएस का 0.3 एमएल, 30% एक्रिलैमाइड-बिस्एलिलामाइड समाधान का 10 एमएल, 10% अमोनियम पर्सुल्फेट (एपीएस) का 0.15 एमएल और 20 माइक्रोन का टेट्रामेथिलेथिलीनियामाइन (TEMEDED ).
  2. अंतरिक्ष वालों द्वारा अलग दो ग्लास प्लेटों के बीच जेल डाली।
  3. अल्ट्राप्योर आसुत पानी के 12.1 मिलीएल वाले 20 मीटर स्टैकिंग जेल, 0.5 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 6.8), 0.2 मिलीएल का 10% एसडीएस, 2.6 मिलील एक्रिल-बिस एक्रिलैमाइड, 0.1 एमएल 10% एपीएस और 20 माइक्रोन युक्त टेमएड बनाएं।
  4. जब चल रहे जेल जमना एक स्टैकिंग जेल डालना। ध्यान से लोड हो रही लेन को कास्ट करने के लिए प्लास्टिक सेपरेटर जोड़ें, बुलबुले से बचें। 15-30 min रुको, जब तक जेल जम रहा है।
  5. प्रोटीन मानकों के 5 μL का उपयोग कर जेल लोड करना शुरू करें। चरण 1.8 प्रति लेन से लाइसेट मिश्रण का लोड 20 μL, मधुमक्खी मस्तिष्क के ~ 1/15 या प्रति लेन कुल प्रोटीन के ~ 16 एनजी के अनुरूप। स्टैकिंग जेल में 16 एमए पर 3.5-4 घंटे कुल और रनिंग जेल में 32 एमए के लिए नमूने चलाएं। जब रंग जेल छोड़ देता है तो बंद करो।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे 30 min के लिए 0.45 एमए पर अंतरित करने वाले स्ट्राइकोल्यूलोज झिल्ली (25 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 192 एमएम ग्लाइसिन, 15% मेथनॉल) पर प्रोटीन को स्थानांतरित करें।
    1. इम्यूनोलोटिंग से पहले एसडीएस-पेज के बाद प्रोटीन हस्तांतरण की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, Ponceau S धुंधला समाधान जोड़ें (100 मीटर की अंतिम मात्रा में पानी में प्यूनाऊ एस के 0.1 ग्राम और एसीटिक एसिड के 5 mL जोड़ें)। 1 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और आसुत पानी के साथ तेजी से कुल्ला करें।
    2. प्रत्येक लेन को बॉलपॉइंट पेन के साथ लेबल करें, मस्तिष्क समरूप के साथ दो लेन युक्त झिल्ली को काटें और प्रोटीन मार्कर के साथ एक लेन और प्रत्येक को पश्चिमी दाग इनक्यूबेटिंग बॉक्स में रखें। फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) में 5 न्यूनतम के लिए 3x धोएं जिसमें 0.1% ट्वीन 20 (पीबीएस-टीडब्ल्यू)।
  7. 1 घंटे के लिए एक पश्चिमी दाग इनक्यूबेटिंग बॉक्स में 10% एनजीएस (सामान्य बकरी सीरम के 1 0 mL) के साथ झिल्ली को ब्लॉक करें। 1 0% एनजीएस के 10 मीटर में एंटीबॉडी का 5एल विरोधी बनाएं। एंटी-आरडीएल1 और एंटी-आरडीएल 2 कमजोर (10% एनजीएस प्रत्येक के 10 एमएल में एंटीबॉडी का 5 माइक्रोन) बनाएं। प्रत्येक बॉक्स में अवरुद्ध समाधान को पतला एंटीबॉडी के साथ बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (16-24 घंटे) छोड़ दें।
  8. पीबीएस-टीडब्ल्यू में 5 न्यूनतम के लिए झिल्ली 3x धोएं। 10% एनजीएस पीबीएस-टी में 1:10,000 पर एंटी-खरगोश आईजीजी एचआरपी-कंजुगेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस-टीडब्ल्यू में झिल्ली 3x धोएं, फिर पीबीएस में 1x।
  9. पश्चिमी केमिमिनसेंट एचआरपी सब्सट्रेट का उपयोग करके बैंड का पता लगाएं। आरटी पर दो सब्सट्रेट्स 1:1 (v/v) मिलाएं, सभी झिल्ली को एक ही बॉक्स में रखें और उन्हें आरटी में 2 मिन (लाल बत्ती के साथ अंधेरे कमरे में) के लिए सब्सट्रेट मिक्स से कवर करें । कई एक्सपोजर टाइम के साथ ऑटोरेडोग्राफी फिल्म का उपयोग करके प्रोटीन का पता लगाने के लिए आगे बढ़ें । आमतौर पर एक एंटीबॉडी का परीक्षण एक झिल्ली पर किया जाता है जिसमें दो या तीन लेन पर मस्तिष्क के समान कमजोर पड़ने और वजन मार्कर के साथ एक लेन होता है।

3. इम्यूनोसाइटोकेमिकल प्रक्रियाएं

  1. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए मधुमक् खी दिमाग को विच्छेदित करने के लिए, 30 एस के लिए बर्फ में मधुमक्खियों को स्थिर करें। मधुमक्खियों को स्थिर करने के बाद, मधुमक्खी को कैंची से काट लें और बीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के समाधान में सिर रखें। धूम हुड के तहत काम करें।
    सावधानी: शरीर को ध्यान से निपटाया जाना चाहिए क्योंकि पेट अभी भी डेपुटेशन के बाद डंक मार सकता है।
  2. ध्यान से लेकिन तेजी से एंटीना, यौगिक आंखों को हटा दें, और बैराक्वेर आइरिस कैंची के साथ शीर्ष एक्सोस्केलेटन के चारों ओर काट लें। सिर को 10 मिन के लिए फिक्सिव सॉल्यूशन में बैठने दें। - बाकी एक्सोस्केलेटन को सिर के एक्सोस्केलेटन को हटा दें और बाकी सभी ट्रेकी काट लें।
  3. प्रत्येक मस्तिष्क को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें कम से कम 1 mL 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान हो और 4-8 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें।
  4. एक Erlenmeyer फ्लास्क में 3.8 ग्राम अगारोज और 50 मिलीग्राम आसुत पानी मिलाकर 7.6% अगारोज समाधान करें। जब तक अगारोज तरलीकृत नहीं हो जाता तब तक समाधान को माइक्रोवेव करें।
    नोट: ऊतक कागज का एक छोटा सा टुकड़ा फ्लास्क के उद्घाटन में रखा जा सकता है ताकि हीटिंग के दौरान बह निकला से agarose समाधान को रोकने के लिए ।
  5. फिक्स्ड मधुमक् खी दिमाग (3-4 दिमाग) को 35 एमएम पेट्री डिश में रखें और टिश्यू पेपर के साथ अतिरिक्त फिक्सेटिव को हटा दें। दिमाग के ऊपर तरल अगारोज समाधान डालो। अगारोज में दिमाग को ओरिएंट करें ताकि एंटीना पालि का सामना करना पड़ रहा हो। अगारोज को शांत और जमना की अनुमति दें।
  6. अगारोज जम जाने के बाद, मस्तिष्क युक्त प्रत्येक अगारोज के ब्लॉक काट दें।
  7. वाइब्रेटोम सेक्शनिंग के लिए, नीचे एक हाइड्रोफोबिक जाल के साथ एक टोकरी युक्त प्रत्येक कुएं के साथ एक 24 अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें। प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के 600 माइक्रोन के साथ भरें।
  8. वाइब्रेटोम मशीन का उपयोग करके प्रत्येक ब्लॉक को 70 माइक्रोन क्रॉस सेक्शन में काटें और वर्गों को पीबीएस युक्त टोकरी में रखें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि एक ही मस्तिष्क से वर्गों एक ही टोकरी में रखा जाता है ।
  9. पीबीएस-TX के साथ प्रत्येक 10 मिन के लिए मस्तिष्क वर्ग6x धोएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई फिक्सिव कंतु खंडों में नहीं रहता है। मल्टीवेल प्लेट को ऑर्बिटल शेकर पर रखें और दिमाग को 210 आरपीएम पर धोएं। इससे पहले कि प्रत्येक धोने के लिए ताजा PBS-TX समाधान के साथ PBS-TX समाधान की जगह सुनिश्चित करें । पिछले धोने के दौरान 1% सामान्य गधा सीरम के साथ ब्लॉक करें।
  10. एंटी-mGlutR1 प्राइमरी एंटीबॉडी का परीक्षण करने के लिए, 15 मीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी के 80 माइक्रोन में पीबीएस-टीएक्स के 9 mL जोड़कर एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी का 1:112 कमजोर पड़ना तैयार करें। भंवर ट्यूब संक्षेप में मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से । एंटीबॉडी के कामकाजी कमजोर पड़ने का निर्धारण प्रारंभिक प्रयोगों में किया गया था ।
  11. एंटी-आरडीएल प्राइमरी एंटीबॉडी का परीक्षण करने के लिए, एंटी-आरडीएल पेप्टाइड 1, एंटी-आरडीएल पेप्टाइड 2 के 30 माइक्रोन, और 15 mL सेंट्रलाइज्ड ट्यूब में पीबीएस-टीएक्स के 6 एमसीएल जोड़कर एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी का 1:100 कमजोर पड़ना तैयार करें । भंवर ट्यूब संक्षेप में मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से । एंटीबॉडी के कामकाजी कमजोर पड़ने का निर्धारण प्रारंभिक प्रयोगों में किया गया था ।
  12. प्लेट में प्रत्येक कुएं में एंटीबॉडी समाधान के 800 माइक्रोन जोड़ें। मल्टीवेल प्लेट को कवर करें और प्रकाश जोखिम से गिरावट को रोकने के लिए इसे एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें। एक कक्षीय शेखर पर एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे थाली रखें और 2 घंटे के लिए २१० आरपीएम पर हिला । फिर बिना झटकों के आरटी पर रात भर छोड़ दें ।
  13. रात भर मस्तिष्क के वर्गों को छोड़ दिए जाने के बाद, 10 min के लिए पीबीएस-TX से धोएं। वाशिंग स्टेप 6x दोहराएं।
  14. पीबीएस-टीएक्स के 9 एमएल में सेकेंडरी एंटीबॉडी के 40 माइक्रोन जोड़कर सेकेंडरी एंटीबॉडीज (गधे से खरगोश विरोधी) तैयार करें।
  15. प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 800 μL जोड़ें। प्लेट को कवर करें और इसे एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें। कक्षीय शेखर पर एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे प्लेट रखें और 2 घंटे के लिए 210 आरपीएम पर हिलाएं। फिर इसे रात भर आरटी पर छोड़ दें ।
  16. नियमित पीबीएस समाधान के साथ पीबीएस-TX और 3x के साथ प्रत्येक 10 मिन के लिए मस्तिष्क वर्ग3x धोएं।
  17. आगे की स्लाइड्स में देखें, रोड्रिगेज एट अल20से संशोधित बढ़ते मीडिया/ग्लिसरोल एम्बेडिंग सॉल्यूशन को तैयार करें । 20 mL PBS में बढ़ते माध्यम के 5 ग्राम जोड़ें और एक चुंबकीय उभारने वाला के साथ 16 घंटे के लिए हलचल । ग्लाइसेरोल के 10 mL जोड़ें और एक चुंबकीय उभारने वाला के साथ एक और 16 घंटे के लिए हलचल । 4,000 x ग्रामपर 15 मिन के लिए सेंट्रलाइज, तरल समरूप अधिनेत लें, और 1 एमएल ट्यूबों में अलीकोट करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें
  18. कदम 3.17 में तैयार बढ़ते माध्यम की एक बूंद के साथ स्लाइड पर वर्गों एंबेड, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्लाइड एक मस्तिष्क से वर्गों में शामिल कर रही है ।
  19. संयुग्मित पेप्टाइड्स के साथ इम्यूनोस्टेनिंग का प्रेक्टोर्पशन नियंत्रण
    1. एंटी-आरडीएल और कंजूस पेप्टाइड्स के लिए, एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी के कामकाजी कमजोर पड़ने को इनक्यूबेट करें, इसी पेप्टाइड के साथ रातोंरात टी पर शेकर पर संजोए हुए: कंडीशन 1) 500 μg पेप्टाइड ग्लूटाराल्डिहाइड के माध्यम से कीहोल लिम्पेट हेमोसायनिन (केएलएच) के साथ संयुग्मित; शर्त 2) बिना किसी संकीर्तन के।
    2. 10,000 x ग्राम पर 10 मिन के लिए प्रत्येक मिश्रण अपकेंद्रित्र और दोनों शर्तों से supernatant इकट्ठा (चरण 3.19.1)।
    3. ऊपर वर्णित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ प्रत्येक अलौकिक और प्रक्रिया के साथ मधुमक्खी मस्तिष्क के धारावाहिक वर्गों को इनक्यूबेट करें। धारावाहिक वर्ग ऐसे अनुभाग हैं जो वाइब्रेटोम सेक्शनिंग प्रक्रियाओं के दौरान एक दूसरे का पालन करते हैं, इसलिए मस्तिष्क का एक ही हिस्सा सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण ों के संपर्क में आ जाएगा।
    4. एंटी-mGlutR1 और conjugated पेप्टाइड के लिए, केएलएच के साथ आरटी पर एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी के कामकाजी कमजोर पड़ने को इनक्यूबेट करें, जिसमें10-4 एम पेप्टाइड (कंडीशन 1) और बिना किसी संजूगेट (कंडीशन 2) शामिल है।
    5. 10,000 x ग्राम पर 10 मिन के लिए प्रत्येक मिश्रण अपकेंद्रित्र और दोनों नियंत्रण ों से supernatant इकट्ठा।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी (चरण 3.14-3.15) के साथ दोनों स्थितियों और प्रक्रिया से अलौकिक के साथ मधुमक्खी मस्तिष्क के धारावाहिक वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    7. एम्बेडिंग मीडिया (चरण 3.17) का उपयोग करके स्लाइड पर दोनों स्थितियों से अनुभागों को एम्बेड करें।

4. इसी CRISPR-Cas9 प्रणाली के इंजेक्शन के बाद मधुमक् खी मस्तिष्क में इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (धारा 3) द्वारा RDL और mGlutR1 प्रोटीन अभिव्यक्ति का परीक्षण

  1. AmRdl (XM_006565102.3) के जीनोमिक डीएनए दृश्यों और mGlutR1 (XM_006566244.3)(तालिका 1)के दृश्यों का उपयोग करके एक ऑनलाइन CRISPR-Cas9 डिजाइन उपकरण21 का उपयोग करगाइड डिजाइन करें । 5 के अंत में फ्लोरोसेंट डाइस ATTO550 के साथ Cas9 crRNA और Cas-9 tracrRNA के रूप में आदेश । आदेश Cas9 Nuclease V3 (सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. न्यूक्रेस-मुक्त पानी का उपयोग करके प्रत्येक गाइड सीआरआरएनए और ट्रेसरना का 100 माइक्रोन स्टॉक बनाकर CRISPR-Cas 9 सिस्टम के लिए घटक तैयार करें। अलीकोट और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर। कैस-9 समाधान की कार्य एकाग्रता तैयार करें कैस 9 न्यूक्लीज वी3 (10 मिलीग्राम/एमएल) के 47.5 माइक्रोन को न्यूक्लियोटाइड फ्री बफर के 47.5 माइक्रोन को जोड़कर 0.5 μg/μL की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करें। इंजेक्शन के लिए जीआरएनए और आरएनपी बनाएं।
  3. प्रत्येक गाइड आरएनए के लिए अलग से आरआरएनए जटिल गठन तैयार करें (गाइडआरएनए: ट्रेकरनाटो550)
    1. एसआरएनए के नाम के साथ एक परीक्षण ट्यूब लेबल करें, न्यूक्लियोटाइड फ्री बफर के 92 माइक्रोन जोड़ें, 100 माइक्रोईआर CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550, और गाइड क्रैना समाधान के 4 μL के 4 μL। धीरे-धीरे मिलाएं और स्पिन लें।
      नोट: आरडीएल के लिए जीआरएनए ट्यूबों की लेबलिंग का उदाहरण: जीआरएल1, जीआरएल2, जीआरएल3 (तालिका 1में आरडीएल गाइड आरएनए के अनुरूप)। mGlutR1 के लिए GRNA ट्यूबों की लेबलिंग का उदाहरण: GMGL1, GMGL2, GMGL3(तालिका 1)।
    2. जीआरएनए बनाने के लिए 5 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक घोल गर्म करें। 10 मिन के लिए आरटी पर मिश्रण ठंडा।
  4. आरएनपी जटिल गठन (GRNA: S.p Cas9Nuclease), वितरण मिश्रण, और नियंत्रण तैयार करें।
    1. आरएनपी के नाम के साथ एक परीक्षण ट्यूब लेबल, gRNA समाधान के 6 μL और 0.5 μg/μL S.p Cas9 Nuclease V3 के 6 μL जोड़ें । इंजेक्शन से पहले 10 मीटर के लिए धीरे-धीरे मिलाएं और समाधान ों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कर लें।
      नोट: आरएनपी ट्यूब लेबल का उदाहरण: RRDL1, RRDL2, RRDL3।
    2. एक RNPRDLmix बनाओ। इंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले अंतिम मिश्रण को तैयार करने के लिए, आरआरएल से प्रत्येक आरएनपी के 4 माइक्रोन को एक साथ जोड़ें। आरएनपी/आरडीएल मिक्स = 4 माइक्रोनएल आरआरडीएल1 + 4 माइक्रोनएल आरआरडीएल + 4 माइक्रोनआरडीएल आरआरडीएल3 ।
    3. एक RNPmGlutR1mix बनाओ। इंजेक्शन (RNPmGlutR1mix) = 4 μL RMG1 + 4 μL RMG2 + 4 μL RMG3 के लिए इस्तेमाल किया अंतिम मिश्रण तैयार करने के लिए mGlutR1 से प्रत्येक RNP के 4 μL मिश्रण ।
      नोट: आरएनपी ट्यूब लेबल का उदाहरण: आरएमजी1, आरएमजी2, आरएमजी3।
    4. ट्रेकर्णा के 4 माइक्रोन, बफर के 92 माइक्रोन और गाइडआरएनए के बजाय पानी के 4 माइक्रोन को मिलाकर एक नियंत्रण नोगाइडना समाधान बनाएं (सेक्शन 4.3 देखें)। नियंत्रण इंजेक्शन समाधान का उत्पादन करने के लिए इस नोगाइडआरएनए समाधान के 6 माइक्रोन और 0.5 μg/μL Cas9 Nuclease V3 (चरण 4.4.1) के 6 μL मिलाएं।

5. इंजेक्शन प्रक्रिया

  1. प्रत्येक मधुमक्खी को चरण 1.3 में वर्णित स्थिर करें और उन्हें चरण 1.4 में खिलाएं। इसके बाद, इंजेक्शन के बाद मधुमक्खियों को छोड़ने के लिए दो लकड़ी के बक्से के दो सेट तैयार करें: एक सफेद बॉक्स (प्रयोगात्मक स्थिति) और एक ब्लैक बॉक्स (नियंत्रण)। प्रत्येक बॉक्स में एक छोटा कंघी और एक खिला पेट्री डिश होना चाहिए। प्रत्येक बॉक्स का एक तरफ अवलोकन के लिए अनुमति देने के लिए कांच से बना है।
    1. पेट्री व्यंजन खिलाएं। 35 एमएम पेट्री डिश का कवर लें, मोम को सतह के अंदर रखें, और पेट्री डिश के नीचे के हिस्से को मोम पर रखें। थाली को बॉक्स में सुरक्षित रखें।
    2. 5 मिलीआर सिरिंज का उपयोग करके, कवर और डिश के नीचे के हिस्से के बीच 1M सुक्रोज समाधान इंजेक्ट करें। मधुमक्खियां जल्दी से दो प्लेटों के बीच अपने सूंड डाल सकते हैं और एक ४८ घंटे ऊष्मायन अवधि के लिए शुष्क रहेगा । प्रत्येक बॉक्स में एक डिश रखो।
  2. माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम तैयार करने के लिए, केशिकाओं को बिना किसी हवा के बुलबुले के खनिज तेल से भरें। केशिकाओं को माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम के इंजेक्टर होल्डर में रखें। वांछित इंजेक्शन समाधान के साथ केशिका लोड करने के लिए, एक फ्लैट सतह पर एक हाइड्रोफोबिक फिल्म रखें, और उस पर समाधान को पिपेट करें। केशिकाओं से तेल इंजेक्ट करें और मिश्रण को इसी आरएनपी मिश्रण के साथ बदलें।
  3. माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम का उपयोग करके, प्रत्येक मधुमक्खी के औसत ओसेली में सीधे आरएनपी मिश्रण समाधान के 345 एनएल इंजेक्ट करें।
    1. आरडीएल-CRISPR-Cas9 इंजेक्शन के लिए, चरण 4.4.2 में वर्णित आरएनआरडीएलमिक्स के साथ आठ मधुमक्खियों को इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के बाद उन्हें 1M सुक्रोज खिलाएं। उन्हें छोटे कंघी के साथ सफेद (प्रयोगात्मक) बॉक्स में छोड़ें और पेट्री डिश को 48 एच के लिए खिलाएं। बिना किसी इंजेक्शन के नियंत्रण के रूप में एक और आठ मधुमक्खियों का उपयोग करें, उन्हें खिलाएं, और उन्हें ब्लैक (कंट्रोल) बॉक्स में छोड़दें।
    2. mGlutR1 CRISPR-Cas9 के लिए, चरण 4.4.3 में वर्णित के रूप में तैयार RNPmGlutR1mix के साथ नौ मधुमक्खियों सुई। नियंत्रण के लिए गाइड के बिना आरएनए मिश्रण के साथ आठ मधुमक्खियों इंजेक्ट (RNAmix_noguide) के रूप में कदम 4.4.4 में वर्णित तैयार किया। इंजेक्शन के बाद उन्हें 1M सुक्रोज खिलाएं। अपने धारकों से मधुमक्खियों को सफेद बॉक्स (प्रायोगिक स्थिति) या धारा 5.1 में वर्णित ब्लैक बॉक्स (नियंत्रण) में छोड़ें।
    3. बक्से को आर्द्रता के लिए गीले कागज के साथ पॉलीस्टीरिन कंटेनर में रखें। मधुमक्खियों को 48 घंटे के लिए छोड़ दें और यह सुनिश्चित करने के लिए प्रति दिन 2x का निरीक्षण करें कि उनके पास पर्याप्त भोजन और अच्छी आर्द्रता है।
  4. 48 घंटे (चरण 3.1) के बाद प्रत्येक मधुमक्खी के मस्तिष्क को विच्छेदन करें और धारा 3 में वर्णित इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए प्रक्रिया करें। एंटी-mGlutR1 इम्यूनोस्टेनिंग के लिए चरण 3.11 का उपयोग करें और एंटी-आरडीएल इम्यूनोस्टेनिंग चरण 3.12 का उपयोग करें।
  5. प्रतिरक्षा-दाग मस्तिष्क वर्गों में फ्लोरेसेंस के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए कॉन्फोकल इमेजिंग करें।
  6. इम्यूनोलेबल दिमाग में प्रोटीन की कमी का मूल्यांकन करने के लिए, नियंत्रण और इंजेक्शन दिमाग दोनों के लिए लाभ के एक ही स्तर पर कॉन्फोकल छवि संग्रह का उपयोग करें।

6. क्यूपीसीआर आधारित ड्रॉप-ऑफ परख CRISPR Cas9 RNPRDLmix इंजेक्शन के बाद संशोधित जीनोमिक आरडीएल डीएनए 48 एच का मूल्यांकन करने के लिए

  1. CRISPR-Cas9 इंजेक्शन द्वारा संशोधित डीएनए की मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए प्राइमर, नियंत्रण जांच और ड्रॉप-ऑफ जांच डिजाइन करें। प्रत्येक प्राइमर को इसलिए डिज़ाइन किया गया है ताकि यह कम से कम एक CRISPR-कै 9 गाइड को फ्लैंक करता है और एम्प्लिसन का आकार 132 बीपी है। उपयोग किए गए प्राइमर और जांच नीचे दिए गए हैं:
    RDL1_For: CTCGGAGTGACCGT
    RDL1_Rev: CAACGAGGCGAACACCAT
    RDL1_control_probe: /5HEX/CGA+C+G+TTT+A+ C+CT/3IaBkFQ/
    RDL1_Drop-off_probe: /56-FAM/CCTA + C+G+T+CA+A+GT/3IaBkFQ/
    1. सुनिश्चित करें कि प्राइमर अद्वितीय दृश्यों के अनुरूप हैं जो क्षेत्र के लिए विशिष्ट हैं। सुनिश्चित करें कि ड्रॉप-ऑफ जांच उस क्षेत्र के लिए डिज़ाइन की गई है जो आरडीएल-CRISPR-Cas9 गाइड के साथ ओवरलैप करता है।
  2. परीक्षण करने के लिए यदि गाइड क्षेत्र में जीडीएनए का संशोधन है, तो चरण 5.3.1 में वर्णित RNP_RDL मिश्रण के साथ ओसेली में 12 मधुमक्खियों को इंजेक्ट करें और नियंत्रण के रूप में आठ अइंजेक्शन मधुमक्खियों का उपयोग करें।
  3. इंजेक्शन के बाद ऑप्टिक पालि 48 एच के बिना मधुमक्खी दिमाग को काटना और निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद किट का उपयोग करके प्रत्येक इंजेक्शन और नियंत्रण मधुमक्खी दिमाग (ऑप्टिक पालि के बिना) के जीडीएनए निकालें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निकाले गए जीडीएनए की मात्रा, गुणवत्ता और शुद्धता का मूल्यांकन करें।
  5. क्यूपीसीआर-आधारित ड्रॉप-ऑफ प्रोटोकॉल और रियल टाइम पीसीआर साइकिलर का उपयोग करके एएमडीएल के संशोधित जीडीएनए की सापेक्ष अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें।
    1. ओलिगोस को 100 माइक्रोन पर फिर से निलंबित करें, प्राइमर को 10 माइक्रोन तक पतला करें, और जांच को 5 माइक्रोन तक करें।
    2. 96 अच्छी तरह से प्लेट में पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थापना के रूप में जीडीएनए के एक नमूने के लिए यहां दिखाया गया है (3 दोहराता है): मास्टर मिक्स के 10 μL (सामग्री की मेजदेखें), आगे प्राइमर के 1 μL, रिवर्स प्राइमर के 1 μL, नियंत्रण जांच के 1 μL, ड्रॉप-ऑफ जांच के 1 μL, जीडीएनए के 2 μL (५० एनजी), nuclease के 4 μL-मुक्त पानी के लिए अंतिम प्रतिक्रिया लाने के लिए 20
      नोट: नियंत्रण जांच के बजाय नमूनों और पानी के बजाय समाधान कर रहे हैं ।
    3. एक वास्तविक समय पीसीआर साइकिल के लिए इस प्रकार साइकिल कार्यक्रम की स्थापना: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और उसके बाद 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस।
  6. 2-10Ct विधि का उपयोग करके सापेक्ष जीन संशोधन का मूल्यांकन करें, जहां
    और

7. आरएनआरडीएलमिक्स इंजेक्शन के बाद आरडीएल आरएनए 48 एच का सापेक्ष परिमाणीकरण

  1. यह परीक्षण करने के लिए कि क्या आरडीएल एमआरएनए में कमी है, ओसेली में 20 मधुमक्खियों को RNP_RDL मिश्रण के साथ इंजेक्ट करें, जैसा कि चरण 5.3.1 में वर्णित है और 12 अनइंजेक्टेड मधुमक्खियों को नियंत्रण के रूप में उपयोग करें। इंजेक्शन के बाद मधुमक्खी दिमाग (ऑप्टिक पालि के बिना) 48 एच को काटना, प्रत्येक इंजेक्शन मधुमक्खी से कुल एमआरएनए निकालें, और निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. डीएनए-फ्री किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके नमूने में शेष किसी भी डीएनए अवशेष को हटा दें।
  3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निकाले गए आरएनए की गुणवत्ता और शुद्धता का मूल्यांकन करें।
  4. एक 384 अच्छी तरह से प्लेट के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक वास्तविक समय पीसीआर साइकिल र पर एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट ग्रीन आरटी-पीसीआर किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके AmRDL की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: इस प्रयोग में, पहले प्रकाशित प्राइमर का उपयोग किया गया था। AmRDL के लिए (ggTCGATGGTACTACCTG AmRDL_F; AmRDL_R TCGATCGACTTGACGTAGA)22 और एक संदर्भ जीन के रूप में ऐक्टिन प्राइमर [AmActin_F TGCCAACACTACTGTCCTCTG; AmActin_R GAATTGACCCCCACCA]23। सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना 2-10Ct विधि (चरण 6.6) का उपयोग करके की गई थी।

8. qPCR आधारित ड्रॉप-ऑफ परख संशोधित जीनोमिक डीएनए 48 एच का मूल्यांकन करने के लिए RNPmGlutR1mix इंजेक्शन के बाद

  1. CRISPR-Cas9 इंजेक्शन द्वारा संशोधित डीएनए की मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए प्राइमर, नियंत्रण और ड्रॉप-ऑफ जांच डिजाइन करें। प्राइमर डिजाइन ताकि वे कम से कम एक CRISPR-कै 9 गाइड पार्श्व और एम्प्लिकन आकार 96 बीपी है।
    mGlutR1_For: GGTGAAACGAGAGACGGA
    AmGlurR1_Rev: GGAGAGAGGGAGCGAGAA
    AmGlurR1_control_probe: /5HEX/CGAGG+G+AAA + CGA+GT/3IaBkfQ/
    AmGlurR1_Drop-off_probe: /56-FAM/CGA + C+A+ C+CG+TC/3IABkFQ/
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्राइमर अद्वितीय दृश्यों के अनुरूप हैं जो उस क्षेत्र के लिए विशिष्ट हैं जिन्हें संशोधित किया जाना चाहिए था। ड्रॉप-ऑफ जांच उस क्षेत्र के लिए डिज़ाइन की गई है जो CRISPR-Cas9 गाइड के साथ छा गया था।
  2. परीक्षण करने के लिए यदि गाइड क्षेत्र में जीडीएनए का संशोधन है, तो RNP_ ग्लूटीआर 1 मिश्रण के साथ ओसेली में 12 मधुमक्खियों को इंजेक्ट करें, जैसा कि चरण 5.3.1 में वर्णित है और नियंत्रण के रूप में आठ अइंजेक्शन मधुमक्खियों का उपयोग करें।
  3. इंजेक्शन के बाद मधुमक्खी दिमाग (ऑप्टिक पालि के बिना) 48 एच को काटना और निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके प्रत्येक इंजेक्शन और नियंत्रण मधुमक्खी मस्तिष्क (ऑप्टिक पालि के बिना) से जीडीएनए निकालें।
  4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निकाले गए जीडीएनए की मात्रा, गुणवत्ता और शुद्धता का मूल्यांकन करें।
  5. qPCR ड्रॉप-ऑफ प्रोटोकॉल का उपयोग करके और चरण 6.5 में वर्णित वास्तविक समय पीसीआर साइकिलर के लिए जीडीएनए AmGlutR1 के सापेक्ष संशोधन की मात्रा निर्धारित करें।
  6. 2-10Ct विधि का उपयोग करके सापेक्ष जीन संशोधन का मूल्यांकन करें, जहां
    और

9. RNPmGlutR1mix इंजेक्शन के बाद mGlutR1 आरएनए 48 एच का क्वांटिफिकेशन

  1. परीक्षण करने के लिए यदि mGlutR1 आरएनए mRNA में कमी है, RNP_RDL मिश्रण के साथ ocelli में छह मधुमक्खियों सुई के रूप में कदम ५.३.२ में वर्णित है और नियंत्रण के रूप में छह अइंजेक्शन मधुमक्खियों का उपयोग करें । इंजेक्शन के बाद मधुमक्खी दिमाग (ऑप्टिक पालि के बिना) 48 एच को काटना, प्रत्येक इंजेक्शन मधुमक्खी से कुल एमआरएनए निकालें, और आरएनए अलगाव के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. डीएनए-फ्री किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके नमूने में शेष किसी भी डीएनए अवशेष को हटा दें।
  3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निकाले गए आरएनए की गुणवत्ता और शुद्धता का मूल्यांकन करें।
  4. 384 अच्छी तरह से किट के लिए प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के साथ वास्तविक समय पीसीआर साइकिलर पर एक SYBR ग्रीन आरटी-पीसीआर किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके mGlutR1 की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें। mGlutR1 (ccTCCTCAACGTCCTTCATA mGlut_F के लिए निम्नलिखित प्राइमर का उपयोग करें; mGlut_R TGCCGGTGTTCCGATTT) और संदर्भ जीन के रूप में ऐक्टिन प्राइमर [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTCTG; AmActin_R गात्गासीसीसीसीका]। 2-10Ct विधि (चरण 8.6) का उपयोग करके सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना करें।

Representative Results

एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी टेस्ट
एंटीबॉडी को आरडीएल पेप्टाइड कॉन्जुगेट्स के खिलाफ तैयार किया गया था जैसा कि फिगर 1एमें दिखाया गया है । एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी की विशेषता में पहला कदम मधुमक्खी मस्तिष्क से निकाले गए प्रोटीन के समरूप की जांच करना है जो एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी और एचआरपी-लेबल बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी सेकेंडरी एंटीबॉडी(चित्रा 1ए,डालें) के साथ पश्चिमी दाग का उपयोग कर रहा है। दोनों विरोधी RDL एंटीबॉडी ~ 50-60 केडी (तीर) पर स्थित बैंड को मान्यता दी, RDL उपunit आइसोफॉर्म प्रोटीन के अनुमानित वजन के अनुरूप । यह प्रदर्शित करने के लिए कि एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी ने मस्तिष्क स्लाइस में पेप्टाइड को पहचाना, हमने एक प्रेक्टोर्पशन नियंत्रण(चित्रा 1बी, सी)का उपयोग किया। जब एंटीबॉडी को संयुग्मित पेप्टाइड्स के साथ प्रीइनक्यूबेट किया गया था, तो अनुभाग पर धुंधला पनअनुपस्थित था। इससे पता चला कि एंटी-आरडीएल एंटीबॉडीने उस कंजुगेड पेप्टाइड को पहचाना जिसके खिलाफ उन्हें उठाया गया था । यह प्रदर्शित करने के लिए कि एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी निश्चित मस्तिष्क ऊतक में प्रोटीन को पहचानते हैं, हमने कोशिकाओं में आरडीएल प्रोटीन पैदा करने वाले आरडीएल जीन को नॉकआउट करने के लिए CRISPR-Cas9 का उपयोग किया। चित्रा 1D1-3,नियंत्रण ललाट मधुमक्खी मस्तिष्क वर्गों कि विरोधी RDL एंटीबॉडी के साथ लेबल थे दिखाता है । इस मधुमक्खी को आरडीएल-CRISPR-Cas9 RNP के साथ इंजेक्ट नहीं किया गया था । चित्रा 1D1में, मधुमक्खी मस्तिष्क के ललाट अनुभाग में एंटी-आरडीएल लेबल न्यूरोपिल्स। चित्रा 1D2 में एक ही ललाट अनुभाग ATTO550 से फ्लोरेसेंस की अनुपस्थिति को दर्शाता है, क्योंकि आरडीएल-CRISPR-Cas9 परिसर इंजेक्शन नहीं था ।

चित्रा 1E1-E3 आरआरएल-CRISPR-कैस 9 के साथ इंजेक्शन मधुमक्खी से एक मस्तिष्क अनुभाग से पता चलता है और फिर चित्रा 1D1-D3में नियंत्रण मस्तिष्क के रूप में एंटीबॉडी की एक ही राशि के साथ संसाधित । इंजेक्शन के बाद पूरे मस्तिष्क 48 एच में एंटी-आरडीएल धुंधला होना काफी कम हो गया था, और मस्तिष्क में एटीटी550 धुंधला(चित्रा 1E2)का वितरण मधुमक्खी मीएनेली में आरडीएल-CRISPR-Cas 9 इंजेक्शन की सफलता को दर्शाता है। मस्तिष्क की कई बिखरी हुई कोशिकाएं ATTO550 प्रदर्शित करती हैं। आरडीएल-CRISPR-कैस 9 के सफल इंजेक्शन ने नियंत्रण(चित्रा 1E1-3)की तुलना में प्रोटीन अभिव्यक्ति को कम कर दिया। आठ इम्यूनोदाग मधुमक्खी दिमाग से, केवल एक मस्तिष्क मशरूम शरीर, प्रोटोसेरेब्रम, और एंटीनाल पालि की कोशिकाओं में RDL-CRISPR-Cas9 के वितरण के एक उच्च स्तर था, जबकि अंय दिमाग मशरूम शरीर कैलिक्स, केंद्रीय परिसर में ATTO550 के साथ सेल धुंधला था, लेकिन एंटीनाल पालि नहीं । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन मधुमक्खियों में, एंटी-आरडीएल इम्यूनोस्टेनिंग में कमी चित्रा 1ई1में दिखाए गए मस्तिष्क में नाटकीय नहीं थी।

इसके बाद, आरडीएल-CRISPR-Cas9 इंजेक्शन के बाद मधुमक्खियों 48 एच में संशोधित आरडीएल जीडीएनए के स्तर का अनुमान लगाने के लिए, हमने एक क्यूपीसीआर ड्रॉप-ऑफ परीक्षण किया, जहां ड्रॉप-ऑफ जांच को आरडीएल जीआरएनए में से एक के क्षेत्र से मेल खाने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इन प्रयोगों में, आरडीएल-CRISPR-कैस 9 के साथ इंजेक्शन मधुमक्खी दिमाग में, फ्लोरेसेंस की सापेक्ष कमी नमूनों में संशोधित जीडीएनए की संख्या के अनुरूप थी। हमारे परीक्षणों में आरडीएल-CRISPR-Cas9 के साथ इंजेक्शन 12 मधुमक्खियों में जीडीएनए में इस गाइड के अनुरूप क्षेत्र गैर इंजेक्शन मधुमक्खियों में जीडीएनए(चित्रा 3ए)की तुलना में 64% ± (मतलब ± 30% एसडी) थे।

इसके बाद, इंजेक्शन के बाद मधुमक्खियों 48 एच में आरडीएल आरएनए के स्तर का अनुमान लगाने के लिए, हमने मधुमक्खियों के एक अलग समूह(चित्रा 3बी)में क्यूआरटी-पीसीआर का प्रदर्शन किया। हमने आरडीएल-CRISPR-कै स 9 इंजेक्शन मधुमक्खियों (एन = 19) के RDL आरएनए के स्तर की तुलना मधुमक्खियों में आरएनए के स्तर के साथ की जो इंजेक्शन नहीं थे (एन = 12)। इन प्रयोगों में, एमआरएनए आरडीएल की सापेक्ष कमी गैर-इंजेक्शन मधुमक्खियों में आरएनए के स्तर की तुलना में 59% ± (मतलब ± 15% एसई) थी। जब हमने व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक मधुमक्खी में आरडीएल आरएनए के स्तर की जांच की, तो 19 मधुमक्खियों में से केवल 13 मधुमक्खियों ने आरएनए की महत्वपूर्ण कमी दिखाई। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि ओसेली के माध्यम से आरडीएल-CRISPR-Cas9 का इंजेक्शन हमेशा बड़ी संख्या में मस्तिष्क कोशिकाओं तक नहीं पहुंच सकता है, जो आरडीएल प्रतिरक्षा-दाग RDL-CRISPR-Cas9 इंजेक्शन मधुमक्खियों के साथ डेटा की पुष्टि करता है । इन तैयारियों में, 8 में से केवल एक मधुमक्खी में कई मस्तिष्क कोशिकाओं (मशरूम शरीर, प्रोटोसेरेब्रम और एंटीनाल पालि) में आरडीएल कुरकुरा-Cas9 था, जबकि आरडीएल-CRISPR-Cas9 का वितरण प्रोटोसेरेब्रम (मशरूम बॉडी कैलिक्स और सेंट्रल कॉम्प्लेक्स) में कोशिकाओं में केंद्रित था, लेकिन एंटीनाल लोब(चित्रा4-डी)नहीं था।

एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी परीक्षण
हमने ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (चित्रा 2ए)के लिए विशिष्ट संयुग्मित पेप्टाइड्स के खिलाफ खरगोश में उत्पादित एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी का उपयोग किया। इस पेप्टाइड का अनुक्रम मधुमक्खी पेप्टाइड (CLSDKTRFDYFARTVPPD) चित्रा 2एके साथ एक 94% पहचान दिखाता है। सबसे पहले, हमने इम्यूनोलोटिंग का उपयोग करके मधुमक्खी मस्तिष्क प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी की जांच की। मधुमक्खी मस्तिष्क समरूप 10% एसडीएस-पेज से अलग हो गया था और इलेक्ट्रोफोरेरेटिक रूप से एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित हो गया था और एंटी-mGlutR1 के साथ दाग दिया गया था। चित्रा 2ए में डालने से अनुमानित वजन (103 और 83 केडी) के साथ दो बैंड दिखाई देते हैं जो दो आइसोफॉर्म के अनुरूप हैं। जब हमने मधुमक् खी दिमाग पर इस एंटीबॉडी का परीक्षण किया, तो हमने पाया कि वे मधुमक्खी मस्तिष्क वर्गों में न्यूरोपिलर प्रोफाइल और कोशिकाओं को चित्रा 2बी, डीमें सचित्र लेबल करते हैं। conjugated-mGlutR1 पेप्टाइड के साथ विरोधी mGlutR1 एंटीबॉडी के preadsorption के बाद, विशिष्ट धुंधला मधुमक्खी मस्तिष्क टुकड़ा(चित्रा 2सी)में गायब हो गया । यह पुष्टि करता है कि एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी पेप्टाइड(चित्रा 2सी)को पहचानते हैं। इसके बाद, हमने मीडियन ओसेली में mGlutR1-CRISPR-Cas9 का मिश्रण इंजेक्ट किया और नियंत्रण नोगाइडना का उपयोग किया। नियंत्रण मधुमक्खियों (एन = 7) में, ATTO550 से फ्लोरेसेंस कोशिकाओं में केंद्रित नहीं था। कुछ दिमाग ों ने फ्लोरेसेंस ATTO550 लेबलिंग बिखेरी थी। इस प्रकार, चित्रा 2D1-3 में नियंत्रण तैयारी मस्तिष्क में एंटी-mGlutR1 धुंधला दिखाती है लेकिन एटीटी550 फ्लोरेसेंस नहीं। जब mGlutR1-CRISPR-Cas9 ocelli में इंजेक्शन और कई कोशिकाओं द्वारा लिया गया था, माध्यमिक एंटीबॉडी के फ्लोरेसेंस के स्तर को काफी क्षेत्र है कि कार्यात्मक mGlutR1RNP(चित्रा 2E1-3)uptakes में कम हो गया था । मधुमक्खियों को ४८ घंटे के लिए निगरानी की गई थी, और प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति से एक मधुमक्खी मृत पाई गई थी । इस प्रकार, इस प्रयोग में, हमने सात नियंत्रण मधुमक्खियों और आठ CRISPR-Cas9 मधुमक्खियों की जांच की। CRISPR-Cas9 के साथ इंजेक्शन सभी मधुमक्खियों कोशिकाओं कि mGlutR1-CRISPR-Cas9 में ले लिया था । इनमें से अधिकांश कोशिकाएं मशरूम बॉडी कैलिक्स, सेंट्रल कॉम्प्लेक्स और पीछे प्रोटोसेरेब्रम में थीं। सात में से केवल दो मधुमक्खियों मशरूम शरीर, केंद्रीय परिसर, और एंटीनाल पालि में कई कोशिकाओं में ATTO550 लेबलिंग दिखाया । इनमें से एक मधुमक्खियों का एक उदाहरण चित्र ा 2ईमें दिखाया गया है । इन तैयारियों में mGlutR1 धुंधला के स्तर में कमी महत्वपूर्ण थी । अन्य पांच मधुमक्खियों में मशरूम शरीर और पीछे प्रोटोसेरेब्रम में mGlutR1 CRISPR-Cas9 के सफल वितरण के अनुरूप ATTO550 लेबलिंग है लेकिन एंटीनाल लोब में नहीं।

इसके बाद, इंजेक्शन के बाद मधुमक्खियों 48 एच में संशोधित mGlutR1 gDNA के स्तर का अनुमान लगाने के लिए, हमने क्यूपीसीआर-आधारित ड्रॉप-ऑफ परीक्षण किया, जहां ड्रॉप-ऑफ जांच को mGlutR1 गाइड के पास के क्षेत्र में डिजाइन किया गया था। इन प्रयोगों में, mGlutR1-CRISPR-कैस 9 के साथ इंजेक्शन मधुमक्खी दिमाग में, 12 मधुमक्खियों में जीडीएनए के सापेक्ष संशोधन 59% ± (मतलब ± 33% एसडी) गैर इंजेक्शन मधुमक्खियों में gDNA के साथ तुलना में थे(चित्रा 3ए)।

इन परिणामों की पुष्टि मधुमक्खियों के एक अलग समूह में क्यूआरटी-पीसीआर परीक्षणों द्वारा भी की गई थी, जहां हमने आरएनपीएमग्लूटीआर1मिक्स(चित्रा 3बी)के साथ इंजेक्शन के बाद मधुमक्खियों 48 एच में क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करके mGlutR1 आरएनए के स्तर का अनुमान लगाया था। हमने mGlutR1-CRISPR-Cas9 इंजेक्शन मधुमक्खियों (n = 6) के mGlutR1 आरएनए के स्तर की तुलना मधुमक्खियों में आरएनए के स्तर के साथ की जो इंजेक्शन नहीं थे (एन = 6)। इन प्रयोगों में, इंजेक्शन मधुमक्खियों में एमआरएनए mGlutR1 की सापेक्ष कमी 53% ± (मतलब ± 18% एसई) अइंजेक्शन मधुमक्खियों(चित्रा 3बी)के साथ तुलना में थी।

मशरूम शरीर के केन्योन सेल में आरएनपी आरआरएल-CRISPR-Cas9 व्यक्त करने वाली चार विभिन्न मधुमक्खियों से अनुभाग चित्रा 4ए-डीमें दिखाया गया है । उदाहरण मधुमक्खी मशरूम शरीर में ATTO550 फ्लोरेसेंस और एंटीनाल पालि के साथ चित्रा 4ई, एफमें दिखाया गया है ।

मार्गदर्शिकाएँ दृश्यों ग्आरएनए आरएनपी
[गाइडआरएनए: ट्रेकर्आरएन] [gRNA: Cas9 Nuclease]
RDL_Guide1 ACCGTAACGCGCCCGCGCT जीडीएल1 आरआरडीएल1
RDL_Guide2 एसीजीटीसीजीजीसीटीजीजीसीटीजीसीटीजीसीटीजीसीटीजीसीटी जीडीएल2 आरआरडीएल2
RDL_Guide3 CCATGACGAACACGTGCC जीडीएल3 आरआरडीएल3
mGlu_Guide 1 CGAAAGTTATCTGACGGTGTGT जीएमजीएल1 आरएमजीएल1
mGlu_Guide 2 TTCAACGAGCAAGTTCAT जीएमजीएल2 आरएमजीएल2
mGlu_Guide 3 GCAAACGTCGGTAGAGTAGA जीएमजीएल3 आरएमजीएल3

तालिका 1: आरडीएल और mGlutR1के लिए डिज़ाइन किए गए गाइडों के न्यूक्लियोटाइड दृश्य।

Figure 1
चित्रा 1: एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी का लक्षण वर्णन। (ए)आरडीएल उपइकाई का योजनाबद्ध, जहां गुलाबी मंडलसी में एन-टर्मिनस और पेप्टाइड 1 (इंट्रासेलर सीवीआरएफकेवीएचडीएचकेजीजीजीटीएल-अमिड) में पेप्टाइड 2 (बाह्य सेलुलर सीवीनेकेक्यूएसवाईएफएचआईएटटीएसनेफिरी-अमिड) के स्थानीयकरण का संकेत देते हैं। एक में डालने मधुमक् खी मस्तिष्क इसी विरोधी RDL एंटीबॉडी (विरोधी RDL pep1 और विरोधी RDL pep2 के साथ एक) के साथ संसाधित अर्क के पश्चिमी दाग में बैंड से पता चलता है । प्रत्येक इम्यूनोब्लॉट आरडीएल उपइकाइयों के विभिन्न आइसोफॉर्म के अनुमानित वजन के अनुरूप प्रोटीन ~ 50-60 केडी के स्पष्ट आकार को दिखाता है। (बी, सी) संयुग्मित पेप्टाइड 1 के साथ एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी का प्रेक्टोर्पशन। सी में छवि अनुभाग में धुंधला में कमी से पता चलता है जब एंटीबॉडी संयुग्मित पेप्टाइड 1 के साथ preincubated थे । प्रशंसक के आकार का शरीर (एफबी) और एलिप्लाइड बॉडी (ईबी) मस्तिष्क में केंद्रीय जटिल संरचनाएं हैं। एम = मशरूम शरीर के मध्यस्थ पालि। (D1-3) 48 एच ग्रीन के बाद नियंत्रण, बिना इंजेक्शन वाले मधुमक्खी मस्तिष्क अनुभाग का एंटी-आरडीएल धुंधला होना मस्तिष्क में एंटी-आरडीएल पॉजिटिव प्रोफाइल को इंगित करता है। (D2) इस मधुमक्खी को इंजेक्ट नहीं किया गया था और इसमें ATTO550 फ्लोरेसेंस नहीं है। (D3) D1 और D3से छवियों को मिला दिया । (E1-3) आरडीएल-CRISPR-Cas9 के इंजेक्शन ने सेल न्यूक्लिय में 48 घंटे(ETO550फ्लोरेसेंस) के बाद एंटी-आरडीएल धुंधला कम कर दिया। (E3) एंटी-आरडीएल (ग्रीन) और एटीटी550 (लाल) की विलय छवि। स्केल बार = 100 माइक्रोन (बी-ई)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी का लक्षण वर्णन। (A)जीसीपीआर एमग्लूर की योजनाबद्ध जो प्रतिरक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर पेप्टाइड को दर्शाता है। तुलना के लिए, एपीआईएस मेलिफेरा पेप्टाइड नीचे दिखाया गया है। सर्कल mGlutR1 रिसेप्टर एक्सट्रासेलुलर डोमेन के एन-टर्मिनस में पेप्टाइड के स्थानीयकरण को इंगित करता है। एक में डालने से पता चलता है कि एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी ने मधुमक्खी दिमाग के पश्चिमी दाग में दो बैंड को मान्यता दी ~ 103 केडी और ~ 83 केडी जो ज्ञात आइसोफॉर्म के अनुमानित वजन के अनुरूप हैं। (बी, सी) एंटील लोब ग्लोमेरिली के लगातार दो वर्गों में एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी का प्रेक्टोर्टियन नियंत्रण। सी में एंटील ग्लोमेरिली सेक्शन में एंटी-mGlutR1 की छवि एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी के साथ एंटी-mGlutR1 पेप्टाइड के प्रीइनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप धुंधलापन की कमी को दर्शाती है। यह प्रक्रिया एंटीबॉडी को समाधान से बाहर निकालने का कारण बनती है, जो बी (नियंत्रण, प्रीनिक्यूबेशन में पेप्टाइड की अनुपस्थिति) की तुलना में धुंधला समाप्त करती है। (D1)औसत ओसेलस में एक नियंत्रण इंजेक्शन के बाद एक मधुमक्खी मस्तिष्क टुकड़ा में विरोधी mGlutR1 के धुंधला दिखाता है । इस इंजेक्शन में mGlutR1 gRNA का अभाव था जो CRISPR-Cas9 द्वारा mGlutR1 रिसेप्टर्स की दस्तक को सक्षम बनाता है, और इस प्रकार एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी का धुंधला (हरा) कम नहीं हुआ था। (D2) ATTO550 फ्लोरेसेंस की अनुपस्थिति मस्तिष्क में कार्यात्मक CRISPR-Cas9 की अनुपस्थिति को इंगित करती है। (D3) विरोधी mGlutR1 और ATTO550 की छवियों को मिला दिया। (E1-E3)एक मस्तिष्क अनुभाग में विरोधी mGlutR1 के धुंधला दिखाजहां mGlutR1 स्थाई रूप से नीचे ४८ घंटे नीचे mGlutR1-CRISPR-कैस 9 के साथ इंजेक्शन के बाद औसत ओसेलस में खटखटाया गया है । इस प्रकार कई कोशिकाओं में mGlutR1 के सफल नॉकआउट के कारण इस मस्तिष्क में धुंधला होना बहुत कम हो जाता है। (E2) मधुमक्खी दिमाग में कई सेल नाभिक में ATTO550 धुंधला इंगित करता है कि mGlut1-CRISPR-Cas 9 का इंजेक्शन सफल रहा। (E3) ATTO550 (लाल) और विरोधी mGlutR1 (हरे रंग) की विलय छवि। स्केल बार = 10 माइक्रोन (बी, सी); 100 माइक्रोन (डी, ई)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: संशोधित gDNA और RDL के mRNA की अभिव्यक्ति और मधुमक्खी दिमाग में mGlutR1 mRNA का मूल्यांकन ४८ घंटे इसी RPN CRISPR-Cas9 के ३४५ nL के साथ इंजेक्शन के बाद । (A)संशोधित क्षेत्र के साथ जीडीएनए की मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए क्यूपीसीआर आधारित ड्रॉप-ऑफ परख परीक्षण की गणना 2-10ct विधि का उपयोग करके की गई थी और नियंत्रण, इंजेक्शन वाले दिमाग के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था। डेटा को मतलब + एसडी के रूप में व्यक्त किया जाता है ।(B)TheqRT-पीसीआर परीक्षण CRISPR-Cas9 इंजेक्शन और अनइंजेक्शन मधुमक्खियों में MRNA की राशि का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । AmActin एक संदर्भ जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था । सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना 2-10ct विधियों का उपयोग करके की गई थी और नियंत्रण, अइंजेक्शन दिमाग के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था। डेटा को मतलब + एसई के रूप में व्यक्त किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ATTO550 फ्लोरेसेंस के माध्यम से मधुमक्खी दिमाग में RNP CRISPR-Cas9 के वितरण का उदाहरण। (ए-डी) चार अलग-अलग मधुमक्खियों से मस्तिष्क वर्ग जो मशरूम शरीर के केन्योन सेल में आरएनपी आरडीएल-CRISPR-Cas9 व्यक्त करते हैं। (ई, एफ) RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9 के साथ इंजेक्शन के बाद दो दिमाग 48 एच का उदाहरण। स्केल बार = 150 माइक्रोन (ए-एफ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

विरोधी RDL और विरोधी mGlutR1 का लक्षण वर्णन
सबसे पहले, हमने फिक्स्ड मधुमक् खी दिमाग के स्लाइस पर इम्यूनोब्लॉट और प्री-एडोप्शन द्वारा एंटी-आरडीएल और एंटी-ग्लूटर1 एंटीबॉडी की विशेषता थी। प्रत्येक एंटीबॉडी को अपने सभी ज्ञात आइसोफॉर्म को पहचानने के लिए बनाया गया था, और पश्चिमी विश्लेषण से पता चलता है कि वे उन बैंडों को पहचानते हैं जो उनके अनुमानित आणविक वजन के अनुरूप हैं। इसके बाद, दोनों एंटीबॉडी को संयुग्मित पेप्टाइड द्वारा अवरुद्ध कर दिया गया था जिसके खिलाफ उन्हें मधुमक् खी मस्तिष्क वर्गों पर उत्पादित किया गया था।

हमारे अध्ययन में पहला उद्देश्य यह स्थापित करना था कि विशिष्ट संयुग्मित पेप्टाइड के खिलाफ उत्पादित एंटीबॉडी निश्चित मस्तिष्क ऊतक में इसके प्रोटीन के लिए विशिष्ट हैं। इसी उद्देश्य से हमने CRISPR-Cas9 प्रणाली का लाभ उठाया । हमने मधुमक् खी RDL और mGlutR1 के लिए विशिष्ट गाइड डिजाइन किए हैं और उनमें से प्रत्येक का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोब ATTO550 के साथ लेबल CRISPR-Cas9 बनाने के लिए किया। प्रत्येक रिसेप्टर के लिए, हमने ओसेली में तीन अलग-अलग CRISPR-Cas9 रिपोन्यूक्लियोप्रोटीन का मिश्रण इंजेक्ट किया ताकि हमारे डिजाइन किए गए Cas9 सिस्टम को लेने वाली कोशिकाओं में संबंधित जीन को नष्ट करके वयस्क मधुमक् खी मस्तिष्क में लक्षित प्रोटीन की मात्रा को कम किया जा सके। अपने अध्ययन में हमने यह कदम पूरा किया।

इन प्रयोगों की सफलता के लिए पहले महत्वपूर्ण चरणों में से एक उपयुक्त गाइड आरएनए डिजाइन कर रहा है। हम शुरुआत, मध्य और जीन अनुक्रम के अंत में स्थित पांच गाइड आरएनए को डिजाइन करने की सलाह देते हैं। हमारे प्रारंभिक कार्य में, हमने उन्हें तीन से पांच मधुमक्खियों पर विभिन्न संयोजनों में परीक्षण किया। हमने इंजेक्शन की विभिन्न सांद्रता के साथ-साथ इंजेक्शन के बाद के समय और इंजेक्शन में आरएनपी के विभिन्न मिश्रणों की भी कोशिश की। हमने दिमाग को विच्छेदित किया और उन्हें एंटी-आरडीएल और एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी का उपयोग करके संसाधित किया। इन प्रारंभिक परीक्षणों में, हमने इंजेक्शन के लिए उपयुक्त संयोजन, इंजेक्शन के बाद का समय, साथ ही इंजेक्शन के लिए CRISPR-Cas9 की एकाग्रता और मात्रा स्थापित की। ये प्रारंभिक परीक्षण उन प्रयोगों को स्थापित करने का आधार थे जो हमने यहां विस्तार से वर्णित किए थे ।

उद्देश्य दो गुना था: 1) एक मधुमक्खी में प्रदर्शित करने के लिए कि हमारे एंटीबॉडी धुंधला CRISPR-Cas9 और 2 के साथ उपचार के बाद कम किया गया था) व्यवहार अध्ययन के लिए सबसे अच्छा प्रयोगात्मक शर्तों के माध्यम से काम करने के लिए । इस प्रकार, हम बताते हैं कि यदि इंजेक्शन के बाद कई सेल नाभिक में CRISPR-Cas9 48 एच शामिल हैं, तो एंटी-आरडीएल और एंटी-mGlutR1 धुंधला की कमी महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, यह दर्शाता है कि परीक्षण किए गए एंटीबॉडी विशेष रूप से मधुमक् खी मस्तिष्क की तैयारी में mGlut1 और RDL प्रोटीन को पहचानते हैं और उनका उपयोग मधुमक् मस्तिष्क में स्थानीयकरण अध्ययन के लिए किया जा सकता है।

व्यवहार अध्ययन के लिए प्रायोगिक सेटिंग CRISPR-Cas9
इसके बाद, हमने प्रयोगों की स्थापना की ताकि CRISPR-Cas9 का उपयोग व्यवहार अध्ययनों में किया जा सके। नियंत्रण और प्रायोगिक उपचार के लिए आठ या नौ मधुमक्खियों को एकत्र किया गया । वे पहले और इंजेक्शन के बाद व्यवहार का परीक्षण किया गया, और फिर उनके दिमाग ATTO550 और/या इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए संसाधित करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों है कि लक्ष्य प्रोटीन की कमी दिखाई निर्धारित किया गया । यहां यह ध्यान रखना आवश्यक है कि प्रयोगों के एक सेट के लिए ली गई मधुमक्खियों की संख्या नियंत्रण और प्रायोगिक स्थितियों के लिए 8-9 मधुमक्खियों से अधिक तक सीमित नहीं थी। इस तरह दोनों स्थितियों का परीक्षण एक ही दिन किया जा सकता है । इसके अलावा, एक बार जब हमने इंजेक्शन के लिए CRISPR-Cas9 मिश्रण तैयार किया, तो हम उन्हें कभी नहीं सील करते हैं। CRISPR-Cas9 मिश्रण शक्ति में परिवर्तन नहीं किया जब एक पंक्ति में 3 दिन का इस्तेमाल किया और 4-8 डिग्री सेल्सियस पर रखा । हालांकि हमने 3 दिन बाद भी इसका परीक्षण नहीं किया।

जैसा कि हमने प्रायोगिक इंजेक्शन के दोनों सेटों के लिए परिणाम अनुभाग में वर्णित किया है और दोनों एंटीबॉडी के लिए, 16 परीक्षण से केवल तीन मधुमक्खियों ने मशरूम शरीर, प्रोटोसेरेब्रम और एंटीनाल लोब में एक बड़ा वितरण ATTO550 दिखाया। अन्य सभी मधुमक्खियों में, CRISPR-Cas9 का वितरण मशरूम शरीर, केंद्रीय परिसर और/या पीछे प्रोटोसेरेब्रम तक सीमित था । किसी भी व्यवहार अध्ययन के लिए यह समझना आवश्यक है कि इस इंजेक्शन विधि का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन की कमी केवल अधिकांश मधुमक्खियों में मशरूम शरीर तक सीमित हो जाएगी। यह एंटीनाल पालि या उपसोफेगलियन तक विस्तारित नहीं होगा। इस प्रकार, इंजेक्शन तकनीक है कि हम उपयोग के व्यवहार प्रयोगों में मशरूम शरीर और केंद्रीय परिसर में रिसेप्टर्स की कमी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, जबकि CRISPR-Cas9 शुरू करने का एक अलग तरीका अंय मस्तिष्क क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए और अधिक उपयुक्त होगा ।

निष्कर्ष में, हमारे अध्ययन मस्तिष्क में एंटीबॉडी धुंधला के लिए एक नियंत्रण के रूप में CRISPR-Cas9 के सफल आवेदन का प्रदर्शन किया । एंटीबॉडी (एंटी-आरडीएल और एंटी-mGlutR1) के लिए, जब mGlutR1-CRISPR-Cas9 या RDL-CRISPR-Cas9 का तेज सफल रहा, तो इसी एंटीबॉडी स्टेनिंग का स्तर भी काफी कम हो गया था। इसके अलावा, यह ध्यान रखना आवश्यक है कि ओसेली में इंजेक्शन के कारण मस्तिष्क में CRISPR-Cas9 का वितरण हुआ जो समरूप नहीं था। वितरण पूरे मस्तिष्क में कई कोशिकाओं के लिए ocelli और मशरूम शरीर के आसपास के एक ंयूनतम क्षेत्र से विविध । इंजेक्शन में भिन्नता के कारण कोशिकाओं द्वारा mGlutR1-या RDL-CRISPR-Cas9 तेज की परिवर्तनशीलता की संभावना थी । हमारे डेटा से पता चलता है कि CRISPR-Cas9 प्रणाली मधुमक्खियों में काम करता है, लेकिन इंजेक्शन की विधि को बेहतर बनाने के लिए व्यक्तिगत मधुमक्खी दिमाग भर में CRISPR-Cas9 तेज की परिवर्तनशीलता को कम करने की जरूरत है । इन प्रतिबंधों के भीतर, अब व्यवहार प्रयोगों के लिए वयस्क मधुमक्खियों में जीन में हेरफेर करने के लिए इस तकनीक को नियोजित करना संभव है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को बीएचएस: ह्यूमन फ्रंटियर्स साइंस प्रोग्राम को निम्नलिखित पुरस्कारों द्वारा समर्थित किया गया था; एनआईएच एनआईएमएस (आर01 जीएम 113967); एनएसएफ आइडियालैब (1556337) । डीएमग्लूरा के लिए पेप्टाइड और एंटीबॉडी प्रयोगशाला में डिजाइन किए गए थे डॉ सर्ज बिरमैन (मार्सिले, ल्यूमिनी, फ्रांस) जब है कार्यक्रम डी ' Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 द्वारा समर्थित था Fondation डालना ला Recherche चिकित्सा । हम डीआरएल गाइड और क्यूपीसीआर ड्रॉप-ऑफ परखों के डिजाइन के साथ मदद के लिए इंटीग्रेटेड डीएनए टेक्नोलॉजी (आईडीटी) से डेनिएला जंक्वेरा मारोसी और एलेक्स हैंटर के लिए आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283_100 mL western blotting
Acrylamide-bis Acrylamide Bio-Rad 500 mL 1610156 western blotting
Agarose Sigma-Aldrich A0169-250g used with distilled water to fix honey bee brain in blocks
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Research Laboratories 711-546-152 secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit
Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO IDT 1075934 with desinged guide RNA, it creates gRNA
Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 IDT 1081058 enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system
Ammonium Persulfate Bio-RAD 10 g 1610700 western blotting
Anti-mGlutR1 antibodies Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical characterized by authors in present paper Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees
Anti-RDL antibodies 21st Century Biochemical characterized by authors in present paper Used for primary incubation of RDL in honey bees
Aprotinin Sigma-Aldrich Y0001154 protease inhibitor
Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point World Precision Instruments 14128-G used for dissection honey bee brain
Benzamidine Sigma-Aldrich 12072 protease inhibitor
Blade (breakable) for blade holder Fine Science Tool 10050-00 dissection for western blotting
Blade holder and breaker Fine Science Tool 15309 dissection for western blotting
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B100 F for injection procedure
Chemiluminescent western blot detection substrate Bio-Rad 1705062 western blotting
Chloroform Sigma-Aldrich 472476-50mL RNA isolation
Dithiothreitol Bio-Rad 1610611 western blotting
DNA easy kit QIAGEN 69504 DNA extractionuj
DNA-free kit INVITROGEN AM1907 Used to remove DNA
Eppendorf Research plus pipette, 3-pack Sigma-Aldrich Z683884
Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell Falcon 351147 Multiwell
Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene Electron Microscopy Science 70021 basket for brain sections
Forceps Dumont #5 (pair) Fine Science Tool 11254-20 for dissection of honey bee brain from the head
Forceps Dumont #5S (pair) Fine Science Tool 11252-00 to clean up the brain from trachea befor dissection
Gene Expression Master Mix Integrated DNA Technologies 1055770 qPCR drop off assay
Glutaraldehyde EMS 16220 used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500 mL western blotting, embedding media
Glycine Bio-Rad 1610718 western blotting
Hydrophobic filtered nylonmesh Spectrum Labs 145910 for bottom of basket for brain sections
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich I9030-50mL RNA isolation
Keyhole limpet hemocyanin Sigma-Aldrich H7017 used for preparation of conjugates for control
LSM800 cofocal microscope Zeiss
mGlu_Guide 1 IDT designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences
mGlu_Guide 2 IDT designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences
mGlu_Guide 3 IDT designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences
methanol Sigma-Aldrich 34860 western blotting
96-well PCR microplate Applied biosystem 4346907 qPCR drop off assay and qRT-PCR
384-well PCR microplate Sigma-Aldrich Z374911 qRT-PCR
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904_500mL for injection procedure
Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co. Capillary Preparation
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 for embedding solution
Nanoliter 2000 World Precision Instruments Nanoliter Injection Apparatus
Normal Donkey Serum Jackson Research Laboratories AB_2337258 blocking agent for immunocytochemistry
Non-immune Goat Serum Invitrogen 50-062Z 100 mL blocking agent for immunoblotting
Nuclease-free buffer IDT 1072570 Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection
Nuclease-free water IDT AM9337 nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system
OrbitalShaker Mp4 Genemate
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500 g used with PBS to make fixative for bee brains
Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626-250 mg protease inhibitor
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies

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References

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न्यूरोसाइंस इश्यू 155 गाबाए रिसेप्टर आरडीएल मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स mGlutR1 conjugated एंटीबॉडी कंट्रोल CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9 का उपयोग कर मधुमक् खी मस्तिष्क वर्गों में एंटी-आरडीएल और एंटी-mGlutR1 रिसेप्टर्स एंटीबॉडी परीक्षण
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Sinakevitch, I., Kurtzman, Z., Choi, H. G., Ruiz Pardo, D. A., Dahan, R. A., Klein, N., Bugarija, B., Wendlandt, E., Smith, B. H. Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9. J. Vis. Exp. (155), e59993, doi:10.3791/59993 (2020).

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