Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati
Summary
Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l’uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.
Abstract
Durotaxis è il processo attraverso il quale le cellule percepiscono e rispondono a gradienti di tensione. Per studiare questo processo in vitro, la rigidità del substrato sottostante una cellula deve essere manipolata. Mentre gli idrogel con rigidità graduata e saggi di migrazione a lungo termine si sono dimostrati utili negli studi di durotassi, le risposte immediate e acute ai cambiamenti locali nella tensione del substrato consentono uno studio mirato dei movimenti delle singole cellule e degli eventi di segnalazione subcellulare. Per testare ripetutamente la capacità delle cellule di rilevare e rispondere alla rigidità del substrato sottostante, viene utilizzato un metodo modificato per l’applicazione di gradienti acuti di maggiore tensione alle singole cellule coltivate su idrogel deformabili che consente in tempo reale manipolazione della forza e della direzione dei gradienti di rigidità impartiti sulle cellule in questione. Inoltre, ottimizzando i dettagli e i parametri dell’analisi, come la forma e le dimensioni della micropipetta o la posizione relativa, il posizionamento e la direzione del gradiente applicato, il saggio può essere ottimizzato per lo studio di qualsiasi tipo di cella e sistema sensibili. Questi parametri possono essere modificati per modificare in modo affidabile lo stimolo applicato ed espandere la funzionalità e la versatilità del saggio. Questo metodo consente l’esame sia del movimento durotattico a lungo termine che dei cambiamenti più immediati nella segnalazione cellulare e nella dinamica morfologica in risposta al cambiamento di rigidità.
Introduction
Negli ultimi decenni, l’importanza delle proprietà meccaniche dell’ambiente di una cellula ha ottenuto un crescente riconoscimento nella biologia cellulare. Tessuti diversi e matrici extracellulari hanno diverse rigidità relative e, quando le cellule migrano in tutto il corpo, navigano questi cambiamenti, utilizzando queste proprietà meccaniche per guidarli1,2,3 , 4 DEL psu’ , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7.Le cellule usano la rigidità di un dato tessuto per informare il loro comportamento motile durante processi come lo sviluppo, la guarigione delle ferite e la metastasi del cancro. Tuttavia, i meccanismi molecolari che permettono la sensazione e la risposta a questi input meccanici rimangono in gran parte sconosciuti1,2,3,4,5, 6 È possibile: , 7.
Per studiare i meccanismi attraverso i quali le cellule rispondono ai segnali ambientali fisici, la rigidità o rigidità delle cellule aderenti sottostanti deve essere manipolata. Nel 2000, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang e colleghi hanno sviluppato un saggio8 in base alla quale la risposta motilica di una singola cellula ai cambiamenti di segnali meccanici potrebbe essere testata direttamente allungando la poliacrilammide rivestita egicolofosa ECM idrogel su cui sono state placcate le cellule. Le cellule mostrano una preferenza significativa per migrare verso substrati più rigidi, un fenomeno che hanno soprannominato “durotaxis”.
Dalla relazione originale del 2000, molte altre tecniche sono state impiegate per lo studio del durotassi. I gradienti di rigidità ripida sono stati fabbricati mediante la colata di gel su caratteristiche rigide come perline in polistirolo9 o pali polimerici rigidi10 o polimerizzando il substrato intorno ai bordi di un vetro coverlips11 per creare meccanica ‘ passo-confini’. In alternativa, gli idrogel con gradienti di rigidità più bassi ma fissi sono stati fabbricati con una varietà di metodi come gradienti di crosslinker creati da dispositivi microfluidici12,13 o goccioline di soluzione idrogel side-by-side di diversa rigidità8, o idrogel con crosslinker fotoreattivo trattati con esposizione alla luce UV graduata per creare un gradiente di rigidità lineare14,15. Queste tecniche sono state utilizzate con grande effetto per indagare il movimento cellulare durotattico in massa nel tempo. Tuttavia, in genere queste caratteristiche sono fabbricate in anticipo rispetto alla placcatura cellulare e le loro proprietà rimangono coerenti nel corso dell’esperimento, basandosi sul movimento casuale delle cellule per il campionamento di gradienti meccanici. Nessuna di queste tecniche è suscettibile di osservazione di rapidi cambiamenti nel comportamento cellulare in risposta a stimoli meccanici acuti.
Per osservare le risposte cellulari ai cambiamenti acuti nell’ambiente meccanico, i saggi durotaxis a singola cella offrono diversi vantaggi. In questi saggi, alle singole cellule viene dato uno stimolo acuto e meccanico allontanando il substrato sottostante dalla cellula con una micropipetta di vetro, introducendo così un gradiente direzionale di tensione cell-matrice. I cambiamenti nel comportamento motile, come la velocità o la direzione della migrazione, sono poi osservati dalla microscopia a contrasto di fase delle cellule vive. Questo approccio facilita l’osservazione diretta delle relazioni di causa ed effetto tra gli stimoli meccanici e la migrazione cellulare, in quanto consente una rapida e iterativa manipolazione della direzione e della grandezza del gradiente di tensione e la valutazione della conseguente risposte cellulari in tempo reale. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per stimolare meccanicamente le cellule che esprimono proteine di fusione fluorescente o biosensori per visualizzare i cambiamenti nella quantità, nell’attività o nella localizzazione subcellulare delle proteine che si sospetta siano coinvolte nella meccanosensing e durotaxis.
Questa tecnica è stata utilizzata da gruppi che studiano durotaxis8,16 ed è descritta qui come è stata adattata dal Laboratorio Howe per studiare il comportamento durotattico delle cellule tumorali ovariche SKOV-3 e i meccanismi molecolari che sotto durotaxis17. Inoltre, viene descritto un metodo modificato per la fabbricazione di idrogel con un singolo strato uniforme di microsfere fluorescenti vicino alla superficie di coltura cellulare; ciò facilita la visualizzazione e l’ottimizzazione dei gradienti di deformazione generati da micropipette e può consentire la valutazione della contrattilità cellulare mediante microscopia della forza di trazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Divenuto qui è un test di durotassire ripetibile e a singola cellula che consente di valutare la capacità di una cellula di alterare il suo comportamento di migrazione in risposta a segnali meccanici acuti. Questa tecnica può essere utilizzata anche in combinazione con la microscopia a fluorescenza e proteine o biosensori di fusione appropriate per esaminare la segnalazione subcellulare e gli eventi citoscheletrici entro secondi di stimolazione meccanica o su una scala cronologica più lunga durante movimento durotatt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nessuno.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
Referências
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Biologia do Desenvolvimento. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
