Studiare il rimodellamento inverso ventricolare sinistro mediante lo scioglimento aortico nei roditori
Summary
Qui descriviamo un protocollo passo-passo di scioglimento dell’aorta chirurgica nel consolidato modello di topi di costrizione aortica. Questa procedura non solo consente di studiare i meccanismi alla base del rimodellamento inverso ventricolare sinistro e della regressione dell’ipertrofia, ma anche di testare nuove opzioni terapeutiche che potrebbero accelerare il recupero del miocardio.
Abstract
Per comprendere meglio il rimodellamento inverso ventricolare sinistro (LV) (RR), descriviamo un modello di roditore in cui, dopo il rimodellamento lv indotto dalla bande aortica, i topi subiscono RR dopo la rimozione della costrizione aortica. In questo articolo, descriviamo una procedura passo-passo per eseguire uno scioglimento aortico chirurgico minimamente invasivo nei topi. L’ecocardiografia è stata successivamente utilizzata per valutare il grado di ipertrofia cardiaca e disfunzione durante il rimodellamento della LV e RR e per determinare la migliore tempistica per lo scioglimento aortico. Alla fine del protocollo, è stata condotta una valutazione emodinamica terminale della funzione cardiaca e sono stati raccolti campioni per studi istologici. Abbiamo dimostrato che lo scioglimento è associato a tassi di sopravvivenza chirurgica del 70-80%. Inoltre, due settimane dopo lo scioglimento, la significativa riduzione del post-carico ventricolare innesca la regressione dell’ipertrofia ventricolare (~20%) e fibrosi (~26%), recupero della disfunzione diastolica valutata dalla normalizzazione del riempimento ventricolare sinistro e delle pressioni end-diastoliche (E/e’ e LVEDP). Lo scioglimento aortico è un utile modello sperimentale per studiare l’LV RR nei roditori. L’estensione del recupero del miocardio è variabile tra i soggetti, quindi, imitando la diversità di RR che si verifica nel contesto clinico, come la sostituzione della valvola aortica. Concludiamo che il modello di bande/scioglimento aortico rappresenta uno strumento prezioso per svelare nuove intuizioni sui meccanismi della RR, vale a dire la regressione dell’ipertrofia cardiaca e il recupero della disfunzione diastolica.
Introduction
La costrizione dell’aorta trasversale o ascendente nel topo è un modello sperimentale ampiamente utilizzato per l’ipertrofia cardiaca indotta dal sovraccarico di pressione, la disfunzione diastolica e sistolica el’insufficienza cardiaca 1,2,3,4. La costrizione aortica porta inizialmente all’ipertrofia concentrica del ventricolo sinistro (LV) compensata per normalizzare lo stress della parete1. Tuttavia, in determinate circostanze, come il sovraccarico cardiaco prolungato, questa ipertrofia è insufficiente a ridurre lo stress della parete, innescando disfunzione diastolica e sistolica (ipertrofia patologica)5. In parallelo, i cambiamenti nella matrice extracellulare (ECM) portano alla deposizione di collagene e al retillo incrociato in un processo noto come fibrosi, che può essere suddiviso in fibrosi sostitutiva e fibrosi reattiva. La fibrosi è, nella maggior parte dei casi, irreversibile e compromette il recupero del miocardio dopo il sollievo dalsovraccarico 6,7. Tuttavia, recenti studi di risonanza magnetica cardiaca hanno rivelato che la fibrosi reattiva è in grado di regredire a lungotermine 8. Complessivamente, fibrosi, ipertrofia e disfunzione cardiaca fanno parte di un processo noto come rimodellamento miocardico che progredisce rapidamente verso l’insufficienza cardiaca (HF).
Comprendere le caratteristiche del rimodellamento miocardico è diventato un obiettivo importante per limitare o invertire la sua progressione, quest’ultimo noto come reverse remodeling (RR). Il termine RR include qualsiasi alterazione miocardica cronicamente invertita da un dato intervento, come la terapia farmacologica (ad esempio, farmaci antipertensivi), la chirurgia valvolare (ad esempio, stenosi aortica) o i dispositivi di assistenza ventricolare (ad esempio, HF cronico). Tuttavia, l’RR è spesso incompleto a causa dell’ipertrofia prevalente o della disfunzione sistolica / diastolica. Pertanto, manca ancora il chiarimento dei meccanismi sottostanti RR e delle nuove strategie terapeutiche, il che è dovuto principalmente all’impossibilità di accedere e studiare il tessuto miocardico umano durante la RR nella maggior parte di questi pazienti.
Per superare questa limitazione, i modelli di roditori hanno svolto un ruolo significativo nel far progredire la nostra comprensione delle vie di segnalazione coinvolte nella progressione HF. Nello specifico, lo scioglimento aortico dei topi con costrizione aortica rappresenta un modello utile per studiare i meccanismi molecolari alla base del rimodellamento avverso dell’LV9 e RR10,11 in quanto consente la raccolta di campioni miocardiali in diversi punti di tempo in queste due fasi. Inoltre, fornisce un’eccellente impostazione sperimentale per testare potenziali nuovi obiettivi in grado di promuovere / accelerare RR. Ad esempio, nel contesto della stenosi aortica, questo modello potrebbe fornire informazioni sui meccanismi molecolari coinvolti nella vasta diversità della risposta miocardica alla base della (in)completezza dell’RR6,12, nonché, la tempistica ottimale per la sostituzione della valvola, che rappresenta una grave lacuna delle conoscenze attuali. In effetti, la tempistica ottimale di questo intervento è oggetto di dibattito, principalmente perché è definita in base all’entità dei gradienti aortici. Diversi studi sostengono che questo punto di tempo potrebbe essere troppo tardi per il recupero del miocardio poiché la fibrosi e la disfunzione diastolica sono spessogià presenti 12.
Per quanto ne sappiamo, questo è l’unico modello animale che riassume il processo di rimodellamento del miocardio e RR che avviene in condizioni come stenosi aortica o ipertensione prima e dopo la sostituzione della valvola o l’insorgenza di farmaci anti-ipertensivi, rispettivamente.
Cercando di affrontare le sfide riassunte sopra, descriviamo un modello animale chirurgico che può essere implementato sia nei topi che nei ratti, affrontando le differenze tra queste due specie. Descriviamo i passaggi principali e i dettagli coinvolti nell’esecuzione di questi interventi chirurgici. Infine, segnalamo i cambiamenti più significativi in atto nell’LV immediatamente prima e in tutto il RR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello proposto nel presente documento imita il processo di rimodellamento dell’LV e RR dopo la fasciatura e lo scioglimento aortici, rispettivamente. Pertanto, rappresenta un ottimo modello sperimentale per far progredire le nostre conoscenze sui meccanismi molecolari coinvolti nel rimodellamento avverso della LV e per testare nuove strategie terapeutiche in grado di indurre il recupero miocardico di questi pazienti. Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi su come creare un modello animale roditore di bande …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (FCT), l’Unione europea, quadro de referência estratégico nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) per il finanziamento dell’unità di ricerca UnIC (UID/IC/00051/2013). Questo progetto è sostenuto da FEDER attraverso COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), il progetto DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), sostenuto dal programma operativo regionale Norte Portugal (NORTE 2020), nell’ambito dell’accordo di partenariato Portogallo 2020, attraverso il Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR), il progetto NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), sostenuto dai Fondi strutturali e di investimento europei, il programma operativo regionale di Lisbona 2020. Daniela Miranda-Silva e Patrícia Rodrigues sono finanziate da Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) con borse di studio (SFRH/BD/87556/2012 e SFRH/BD/96026/2013 rispettivamente).
Materials
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
Referências
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