幹細胞由来ウイルスAg特異的Tリンパ球はマウスにおけるHBV複製を抑制する
Summary
ここに提示されるのは、幹細胞由来ウイルス抗原(Ag)特異的Tリンパ球の養子細胞転写(ACT)を利用してマウスにおけるB型肝炎ウイルス(HBV)複製の効果的な抑制のためのプロトコルである。この手順は、HBV感染の潜在的なACTベースの免疫療法に適合してもよい。
Abstract
B型肝炎ウイルス(HBV)感染は世界的な健康問題である。世界中で3億5000万人以上の人々が罹患しており、HBV感染は依然として肝臓癌の主な原因です。これは、特に発展途上国において大きな関心事です。HBVに対する効果的な応答をマウントする免疫系の障害は、慢性感染につながる。HBVワクチンが存在し、新しい抗ウイルス薬が作成されていますが、ウイルス貯留細胞の根絶は依然として主要な健康問題です。ここで説明するウイルス抗原(Ag)-特異的CD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の生成のための方法は、HBV複製を抑制する能力を有する多能性幹細胞(iPSC)(すなわち、iPSC-CTLs)に由来する。HBV複製は、HBV発現プラスミド、pAAV/HBV1.2の動的誘導を介してマウスで効率的に誘導され、肝臓に誘導される。そして、HBV表面Ag特異的マウスiPSC-CTLが採用的に転移し、肝臓や血液中のHBV複製を大幅に抑制し、肝細胞におけるHBV表面Ag発現を防止する。この方法は、流体力学注入後のマウスにおけるHBV複製を実証し、幹細胞由来のウイルスAg特異的CTLがHBV複製を抑制できることを示す。このプロトコルは、HBV免疫療法のための有用な方法を提供する。
Introduction
急性感染後、適応免疫系(すなわち、体液性および細胞性免疫)は、急性HBV関連肝炎の大部分を制御する。それでも、HBV流行地域の多くの人々は、ウイルスを排除し、その後、慢性的な個人として変換することはできません。世界中の慢性患者の25%以上(>2億5000万人)が進行性肝疾患を発症し、肝硬変および/または肝細胞癌(HCC)1を引き起こす。その結果、ワクチン2が入手可能であり、多数の抗ウイルス薬が開発中であるにもかかわらず、強引に感染した細胞の根絶は、一般的な健康問題のままである。HBV感染の標準的な治療には、IFN-α、ヌクレオシド、ヌクレオチド類似体が含まれる。これらの薬剤は、直接抗ウイルス活性および免疫調節能力を有する。それにもかかわらず、抗HBe抗体(Ab)を有するHBe抗原(Ag)+担体の血清変換および血清HBVデオキシリボ核酸(DNA)の喪失は、治療された患者のおよそ20%に個別に現れ、ウイルスの全免疫学的制御HBsAgの剥奪によって検証された5%以下3.また、治療に対する応答は、多くの場合、耐久性がない。組換えHBs Agによる予防ワクチン接種は感染予防に非常に有効であるが、治療的なHBs Agワクチン接種は有効ではない。明らかに,T細胞媒介性免疫応答はHBV感染および肝障害を制御する上で重要な役割を果たす;しかし、慢性肝炎患者では、HBV反応性T細胞はしばしば削除され、機能不全、または疲弊した4、5、6を変換する。その結果、持続的なHBV感染を有する個体において、抗ウイルス療法、免疫調節性サイトカイン、または治癒免疫によってHBV特異的免疫(すなわち、T細胞ベースの免疫)を復活させる試みは成功していない。
HBV Ag特異的T細胞の養子細胞移植(ACT)は、最終的に残りの肝細胞を根絶するように指示された効率的な治療である。HBV感染マウスに対するHBV特異的CTLのACTは、一過性、軽度の肝炎、および肝細胞におけるHBVリボ核酸(RNA)転写物の劇的な低下を引き起こすことが示されている。これらの研究では、CTLはHBV遺伝子の転写を阻害しなかったが、HBV転写物9の分解を増強した。HBV特異的CTLは、ウイルス感染を予防し、HBV10、11のクリアランスを仲介するために重要である。ACTベースの救済策については、生体内再定住に対する反応性が高いHBV特異的T細胞のインビトロ拡張が理想的な方法12,13,14であることが示唆された。それにもかかわらず、現在のアプローチは、潜在的な治療法のための患者からHBV特異的T細胞の適切な量と品質を生成し、分離し、成長する能力に関して制限されています。
臨床試験は、HBVウイルス感染肝細胞に特異的である工学的T細胞を用いて細胞ベースの治療の安全性、実用性、および将来の治療活性を提示するが、不利な効果に関する懸念がある。T細胞受容体(TCR)15、16、非特異的TCR17によるオフターゲットAg認識およびキメラAg受容体(CAR)によるオンターゲットオフ毒性によるクロス反応性による自己免疫応答から生じる18歳,19健康な組織と.現在、遺伝子組み換えT細胞は、生体内に短期的な持続性しか持てないが、通常は中間またはそれ以降のエフェクターT細胞である。現在までに、多能性幹細胞(PSC)は、ナイーブ単一型Ag特異的T細胞20、21、22、23の多数を生成するために利用可能な唯一の供給源である。誘導PSC(iPSC)は、いくつかの転写因子の遺伝子伝達を使用して患者の体細胞から単に変換されます。その結果、iPSCは胚性幹細胞(ESC)24と同様の特性を持つ。自己更新する無限の能力の柔軟性と可能性のために、組織置換に加えて、iPSCベースの治療は再生医療に広く適用される可能性があります。さらに、iPSCの基礎となる連隊は、現在の細胞ベースの治療法を実質的に改善する可能性がある。
この方法の全体的な目標は、ACTベースの免疫療法のためにiPSC(すなわち、iPSC-CTL)から大量のHBV特異的CTLを生成することです。代替技術に比る利点は、HBV特異的iPSC-CTLが単一タイプのTCRとナイーブ表現型を有し、ACT後により多くのメモリT細胞の発達をもたらすことです。HBV特異的iPSC-CTLsのACTは、肝臓における機能性CD8+T細胞の移行を増加させ、投与マウスの肝臓および血液の両方におけるHBV複製を減少させることを実証した。この方法は、HBV免疫療法に対するウイルスAg特異的iPSC-CTLの潜在的な使用を明らかにし、ウイルス免疫療法のための他のウイルスAg特異的iPSC-T細胞を生成するように適合してもよい。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、マウスモデルにおけるHBV複製を抑制するACTとして使用するためのウイルスAg特異的iPSC-CTLを生成する方法を提示する。慢性HBV感染において、ウイルスゲノムは安定なミニ染色体を形成し、肝細胞の寿命を通して持続しうる共有閉じた円形DNA(cccDNA)を形成する。ウイルスミニ染色体のクリアランスを標的とすると、慢性HBV感染の治癒をもたらす可能性がある。現在の抗ウイル?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、トロント総合病院研究所のアダム・J・ゲーリング博士に対し、HBs183-91(s183)(FLLTRILTI)-特異的A2制限ヒトマウスハイブリッドTCR遺伝子のcDNAを提供してくれたことに感謝し、国立台湾大学のペイ・ジャー・チェン博士に感謝の意を表した。pAAV/HBV 1.2 コンストラクト。この研究は、国立衛生助成研究所R01AI121180、R01CA221867およびR21AI109239からJ.S.にサポートされています。
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
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