Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo
Summary
En este protocolo, los linfocitos se colocan en la cámara superior de un sistema de transmigración, separados de la cámara inferior por una membrana porosa. La quimiocina se añade a la cámara inferior, lo que induce la migración activa a lo largo de un gradiente de quimiocina. Después de 48 h, los linfocitos se cuentan en ambas cámaras para cuantificar la transmigración.
Abstract
Aquí, presentamos un método eficiente que se puede ejecutar con habilidades básicas de laboratorio y materiales para evaluar el movimiento quimiocinético de linfocitos en un sistema de transmigración ex vivo. Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) y las células auxiliares CD4+ T se aislaron de los bazos y los pulmones de los ratones BALB/c con problemas de óvulos de huevo de pollo (OVA). Confirmamos la expresión de CCR4 tanto en células CD4+ T como en ILC2, comparativamente. CCL17 y CCL22 son los ligandos conocidos para CCR4; por lo tanto, utilizando este método de transmigración ex vivo examinamos el movimiento inducido por CCL17– y CCL22 de CCR4+ linfocitos. Para establecer gradientes de quimiocina, CCL17 y CCL22 se colocaron en la cámara inferior del sistema de transmigración. Luego se añadieron linfocitos aislados a las cámaras superiores y durante un período de 48 h los linfocitos migraron activamente a través de poros de 3 m hacia la quimiocina en la cámara inferior. Este es un sistema eficaz para determinar la quimiocinética de los linfocitos, pero, comprensiblemente, no imita las complejidades que se encuentran en los microambientes de órganos in vivo. Esta es una limitación del método que puede superarse mediante la adición de imágenes in situ del órgano y los linfocitos en estudio. Por el contrario, la ventaja de este método es que puede ser realizado por un técnico de nivel de entrada a una tasa mucho más rentable que las imágenes en vivo. A medida que los compuestos terapéuticos están disponibles para mejorar la migración, como en el caso de las células inmunitarias citotóxicas infiltrantes del tumor, o para inhibir la migración, tal vez en el caso de enfermedades autoinmunes donde la inmunopatología es preocupante, este método puede ser utilizado como herramienta de selección. En general, el método es eficaz si la quimiocina de interés está generando constantemente quimiocinética a un nivel estadísticamente más alto que el control de los medios. En tales casos, el grado de inhibición /mejora por un compuesto dado puede ser determinado también.
Introduction
Este método de transmigración original fue presentado por Stephen Boyden en 1962 en el Journal of Experimental Medicine1. Gran parte de lo que sabemos sobre la quimiotaxis y la quimioquinética no sería posible sin el desarrollo de la cámara Boyden. Antes del descubrimiento de la primera quimiocina en 1977, se utilizaban sistemas de transmigración ex vivo para aprender sobre factores séricos que podrían detener el movimiento celular en los macrófagos mientras amplificaban la motilidad celular en neutrófilos1,2. Una enorme riqueza de conocimiento se ha desarrollado con respecto a la migración de células inmunitarias, y hasta la fecha, 47 quimioquinos se han descubierto con 19 receptores correspondientes3,4. Además, multitud de inhibidores/potenciadores de estas vías de quimiocina han sido objeto de desarrollo con fines terapéuticos5,6,7,8. Muchos de esos compuestos se han probado en cámaras de transmigración similares para entender las interacciones directas entre los compuestos y la capacidad de respuesta de las células inmunes a una quimiocinadada 9.
La transmigración, o diapedesis, al tejido inflamado es un proceso esencial para una respuesta inflamatoria saludable para eliminar la infección10,11. Una cámara Boyden, un sistema de transmigración o un aparato transwell se componen generalmente de dos cámaras separadas por una membrana porosa1,12. La cámara inferior a menudo contiene medios que contienen la quimiocina de interés, mientras que los leucocitos se colocan en la cámara superior. El tamaño del poro en la membrana se puede seleccionar en función del tamaño de la célula de interés. Para este proyecto, seleccionamos una membrana porosa de 3 m, ya que las células linfoides tienen un tamaño de 7-20 m, dependiendo de la etapa de desarrollo celular. Este tamaño de los poros asegura que estas células no están cayendo pasivamente a través de los poros, sino que están migrando activamente en respuesta al gradiente de quimiocina.
La principal ventaja de este protocolo es su rentabilidad. La transmigración in vivo es difícil porque requiere un amplio entrenamiento en manejo de animales y cirugía, y a menudo implica microscopía de alta potencia que no siempre está disponible para un investigador. El cribado rentable de compuestos que se cree que mejoran o inhiben la transmigración se puede realizar antes de la toma de imágenes in vivo. Debido a que el sistema de transmigración está estrechamente controlado, las células pueden ser tratadas inicialmente y luego añadidas al aparato transwell, o, viceversa, la quimiocina puede ser tratada primero con un inhibidor de la quimiocina y luego las células añadidas al aparato transwell. Por último, las células endoteliales y/o las proteínas de membrana del sótano se pueden agregar a la parte inferior del inserto transwell 1-2 días antes del experimento de transmigración para entender la implicación de estas células de barrera en la quimiocinética. Una vez más, estas manipulaciones del sistema proporcionan un poderoso medio de determinar información importante sobre la eficacia de un compuesto dado antes de estudios in vivo más complicados.
El uso de un sistema de cámara de transmigración es una forma eficaz de evaluar la movilidad de los linfocitos en diversas condiciones in vivo e in vitro12,13,14. Aquí, describimos un método optimizado para evaluar la capacidad de respuesta de los linfocitos ex vivo a las quimioquinas en una cámara de transmigración. En este experimento de ejemplo, las células CD4+ T y las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) se aislaron de machos y hembras, ratones BALB/c después de la exposición a los alérgenos de OVA. Se generó la hipótesis de que CCR4+ CD45+ Lineage- (LIN-) ILC2 de ratones con alérgenos migrarían más eficientemente hacia CCL17 y CCL22 que las células auxiliares CCR4+ CD4+ T. CCL17 y CCL22 son quimiolinas comúnmente producidas por células dendríticas y macrófagos del fenotipo M2 (alérgico), entre otras células, en alergia15,16. CCL17 y CCL22 pueden considerarse biomarcadores de inflamación alérgica, ya que se detectan fácilmente en los pulmones durante las exacerbaciones de las vías respiratorias16,17,18. Es importante destacar que la expresión CCR4 es elevada en comparación con los controles no tratados, como se revela en los datos bioinformáticos generados a partir de ILC2 aislados de animales tratados con ácaros del polvo de la casa, y de manera similar ILC2 de animales ingenuos tratados ex vivo con IL-33 ( alérgenos que promueven la citoquina innata) upregulates CCR419,20. Además, según los datos de ILC2 en la base de datos del Proyecto Genoma Inmunológico (www.immgen.org), el ARNm CCR4 está muy expresado en estas células inmunitarias innatas. Hasta la fecha, poco se sabe con respecto al tráfico de ILC2 en los tejidos, pero es probable que las células ILC2 y CD4+ T utilicen quimioquinas y receptores similares para la quimiotaxis y quimiocinética, ya que expresan factores de transcripción y receptores similares. Por lo tanto, comparamos CCL17 frente a la capacidad de respuesta CCL22, de linfocitos ILC2 y CD4+ T, tanto de animales machos como de mujeres, con problemas de OVA.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este documento, presentamos un método bien establecido para evaluar la migración inducida por quimiocina de linfocitos en un sistema de transmigración ex vivo. Hay varios pasos críticos en el protocolo, el primero de los cuales es verificar la expresión del receptor de quimiocina correcto en las células inmunitarias en el experimento. En nuestras manos, elegimos CCR4 debido al cuerpo de literatura que destaca la importancia de CCR4 en th2 células T auxiliares en la inflamación alérgica. La inflamación induci…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Asociación Americana del Pulmón (K.J.W.), el fondo Memorial Eugene Kenney otorgado a T.A.W. y K.J.W., generoso apoyo inicial de la Universidad de Utah para K.J.W., y un premio del Departamento de Asuntos de Veteranos a T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. ha recibido un Premio Científico de Carrera de Investigación (IK6 BX003781) del Departamento de Asuntos de Veteranos. Los autores desean reconocer la asistencia editorial de la Sra. Lisa Chudomelka. Los autores agradecen al núcleo de la citometría flow de la CMN por su apoyo en la recopilación de los datos de citometría de flujo generados para este manuscrito.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
| 100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
| 3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
| 3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
| 5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
| 8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
| Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
| Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
| Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
| Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
| compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
| Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
| Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
| mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
| small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
| sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |
Referências
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