कैंसर के लिए एक अधिक शारीरिक प्रणाली के रूप में एक 3 डी Spheroid मॉडल-एसोसिएटेड Fibroblasts भेदभाव और विट्रो अध्ययन में आक्रमण
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक ट्यूमर थोक की तरह वातावरण में कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) के भेदभाव का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक 3 डी स्थापित करना है, जिसे विभिन्न विश्लेषण प्रणालियों में संबोधित किया जा सकता है, जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस, ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण और जीवन कोशिका इमेजिंग.
Abstract
एक इन विट्रो अध्ययन के लिए आदर्श मॉडल को परिभाषित करना आवश्यक है, मुख्य रूप से यदि कोशिकाओं के भेदभाव जैसे शारीरिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करना आवश्यक है। ट्यूमर स्ट्रोमा में, मेजबान फाइब्रोब्लास्ट्स कैंसर कोशिकाओं द्वारा अंतर करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं। इस प्रकार, वे एक phenotype है कि ट्यूमर microenvironment के लिए योगदान देता है और ट्यूमर प्रगति का समर्थन करता है प्राप्त. का उपयोग करके, हमने इन विट्रो मॉडल प्रणाली में इस प्रकार के 3D की स्थापना की है, जिसमें हमने इस विभेदन प्रक्रिया में लेमिनिन-332 की भूमिका और इसके ग्राही integrin का विश्लेषण किया है। यह गोलभॉइड मॉडल प्रणाली न केवल ट्यूमर microenvironment की स्थिति को अधिक सटीक तरीके से पुन: उत्पन्न करती है, बल्कि यह एक बहुत बहुमुखी मॉडल है क्योंकि यह अलग-अलग डाउनस्ट्रीम अध्ययन की अनुमति देता है, जैसे कि अंतर और extracellular दोनों के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला मार्करों, साथ ही जमा extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन. इसके अलावा, QPCR द्वारा प्रतिलेखनीय विश्लेषण, प्रवाह साइटोमेट्री और सेलुलर आक्रमण इस मॉडल के साथ अध्ययन किया जा सकता है. यहाँ, हम एक गोलाभ मॉडल के एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए CAFs की भूमिका का आकलन करने के लिए ‘integrin ]3 और उसके बहिर्मुख रूप से जमा ligand, laminin-332, भेदभाव में और अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं के आक्रमण का समर्थन करने में.
Introduction
ट्यूमर microenvironment एक बहुत ही जटिल आला और ट्यूमर कोशिकाओं के रखरखाव और प्रगति के लिए अत्यंत महत्वपूर्णहै 1. यह न केवल कैंसर कोशिकाओं द्वारा बल्कि स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट्स द्वारा भी बनता है। ट्यूमर कोशिकाएं एक स्ट्रोमा से घिरी होती हैं जो विशिष्ट होती है और सामान्य ऊतकों2के स्ट्रोमा से अलग होती है . Laminin-332 एक extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन बाह्य रूप से विभिन्न ट्यूमर के stroma में व्यक्त की है, इस तरह के अग्नाशय एडेनोकार्सीनोमा3के रूप में. इसके अलावा, ईसीएम की जैव रासायनिक संरचना और इसके जैवभौतिक गुण, जैसे कठोरता और तनाव, ट्यूमर थोक4के भीतर बदल जाते हैं। इस ट्यूमर stroma, या “प्रतिक्रियाशील stroma”, पड़ोसी कैंसर की कोशिकाओं के लिए फाइब्रोब्लास्ट के एक अनुकूलन के कारण होता है और अन्य बहुत महत्वपूर्ण खिलाड़ियों है कि ट्यूमर प्रगति के लिए एक अनुकूल और सहायक वातावरण विकसित की भर्ती के द्वारा. स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट्स के भेदभाव का परिणाम कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) में होता है। इन कोशिकाओं की पहचान विभिन्न मार्करों जैसे कि जेड-स्मूथ मांसपेशी एक्टिन (जेडएसएमए)5 या न्यूरल/ग्लिल प्रतिजन 2 (एनजी2)6का उपयोग करके की जा सकती है।
सीएएफ के साथ ट्यूमर microenvironment (TME) recapitulate करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सबसे उपयुक्त का चयन करने के लिए मुश्किल है। इस तरह के एक मॉडल प्रणाली के लिए एक लागत कुशल और reproduible तरीके से TME के शारीरिक मापदंडों की नकल करने की विधि पर विचार किया जाना चाहिए. TME के भीतर, विभिन्न प्रक्रियाओं, जैसे प्रसार, भेदभाव, प्रवास और विभिन्न सेल प्रकार के आक्रमण होते हैं. इन सेलुलर प्रक्रियाओं अलग अलग तरीकों के साथ व्यक्तिगत रूप से किया जा सकता है. हालांकि, प्रयोगात्मक स्थितियों ट्यूमर stroma ECM के साथ सेलुलर बातचीत पर विचार करना चाहिए, सब्सट्रेटम की कठोरता CAF भेदभाव प्रक्रिया को प्रभावित करती है के बाद से. आर.जी. वेल्स ने सेल व्यवहार पर मैट्रिक्स कठोरता के प्रभाव पर टिप्पणी की और इस बात पर प्रकाश डाला कि इन विट्रो सुसंस्कृत कोशिकाओं में साइटोस्केलेटल संगठन और विभेदन स्थिति कलापूर्ण हो सकतीहै 7. विभिन्न उद्दीपकों में सीएएफ विभेदन में शामिल प्रतीत होता है , जिसमें यांत्रिक तनाव5,7शामिल है . इससे बचने के लिए, 2 डी नरम substrates भेदभाव अध्ययन के लिए संभव दृष्टिकोण हो सकता है, के रूप में वे कड़ी संस्कृति पकवान प्लास्टिक की समस्या को दरकिनार. एक नरम 2 डी सतह, जिस पर फाइब्रोब्लास्ट्स उगाया जा सकता है, कोलेजन-I लेपित पॉलीऐक्रिलमाइड जैल हो सकता है, जिससे जेल कठोरता को पॉलीऐक्रिलमाइड और जेल क्रॉस-लिंकर की एकाग्रता द्वारा हेरफेर किया जा सकता है। जेडएसएमए समृद्ध तनाव फाइबर के आसंजन और गठन को जेल कठोरता8के साथ फाइब्रोब्लास्ट्स में बढ़ाया जाता है। इन परिणामों को इन विट्रो भेदभाव मॉडल में अधिक शारीरिक के लिए नरम सब्सट्रेट पाड़ के महत्व पर जोर दिया. हालांकि, हमारे हाथों में प्रयोगात्मक reproducibility और इन जैल की इमेजिंग चुनौतीपूर्ण थे. इन कमियों को दूर करने के लिए, हम भेदभाव और आक्रमण अध्ययन के लिए एक 3 डी गोलभदाई मॉडल के लिए 2 डी नरम सब्सट्रेट प्रणाली बदल दिया है। इस मॉडल को और अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक है और, एक इन विट्रो organoid के समान, विवो सेल सेल बातचीत में recapitulates, ECM उत्पादन और जमाव, साथ ही सेल व्यवहार9.
स्प्रॉइड तब बनते हैं जब कोशिकाओं में पालन करने के लिए सब्सट्रेट की कमी होती है। जब कोशिकाओं को एक चिपकने वाला सतह के बिना छोड़ दिया जाता है, तो वे एक अधिक या कम गोलाकार संरचना बनाने के लिए कुल। यदि गोलभों को एक प्रकार के कोशिका से बना दिया जाता है, तो उन्हें होमोस्फेरॉइड्स कहा जाता है; यदि दो या दो से अधिक विभिन्न कोशिका प्रकारों से बना है तो वे विषमस्फीत बनाते हैं।
गोलभक् ति तैयारी के लिए विभिन्न विधियों में, हम प्रोटोकॉल गैर-अनुकूल गोल नीचे 96-वेल प्लेटों का उपयोग करते हैं। यह लागत के संबंध में बहुत प्रभावी है. यहाँ, हम फाइब्रोब्लास्ट्स के दोनों homofheroids का उत्पादन, सीएएफ या CAFs integrin की कमी $ 3 subunit भेदभाव प्रक्रिया की जांच करने के लिए और caFs या integrin के heteospheroids 3 KO CAFs और अग्नाशय ी डक्ट कार्सिनोमा कोशिकाओं (AsPC-I और PANC-I) आक्रमण का अध्ययन करने के लिए आसपास के मैट्रिक्स में.
इन अध्ययनों के लिए उद्देश्य मानव अग्नाशय कार्सिनोमा बायोप्सी से अलग प्राथमिक CAFs का उपयोग करने के लिए किया गया था. हालांकि, कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए बायोप्सी दुर्लभ हैं और इस कारण से, इन अध्ययनों में प्रयुक्त सीएएफ को एचईटीईटर युक्त मसूरीवायरस का उपयोग करके अमर कर दिया गया है। वे iCAFs कहा जाता है, और उनके सामान्य समकक्षों, प्राथमिक मानव अग्नाशय फाइब्रोब्लास्ट्स, iNFs कहा जाता है. मानव अग्नाशय फाइब्रोब्लास्ट्स और अग्नाशयी नलिका कार्सिनोमा कोशिकाओं, AsPC-I और PANC-I, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग सीएएफ विभेदन प्रक्रिया में लेमिनिन-332-इंटेग्रिन इंटरैक्शन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गया था। इस बातचीत और उसके कार्य की विशिष्टता को साबित करने के लिए, अवरोधक यौगिकों का उपयोग किया गया: BM2, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जो integrin साइट को ब्लॉक करता है लेमिन-332 $3 श्रृंखला10,या lebein 1, एक साँप व्युत्पन्न जहर यौगिक है कि ब्लॉक लेमिन-बाइंडिंग इनेग्रिन्स ] 3 ]1, ]6 ]1 और ]7]11,12.
आक्रमण परख के लिए, कोशिकाओं cDNA एन्कोडिंग या तो mCherry (iCAFs और integrin ] 3 KO iCAFs) या GFP (AsPC-I और PANC-I) के साथ lentivirus युक्त ट्रांसड्यूसर के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था heterospheroids में विभिन्न प्रकार के भेद करने के लिए. कोशिकाओं के transduction उन्हें अमर करने के लिए और / या उन्हें फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल करने के लिए (मचेरी और GFP) अभिव्यक्ति एक पिछले अध्ययन में वर्णित है13,कि अधिक जानकारी के लिए परामर्श किया जाना चाहिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएएफ भेदभाव का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयुक्त विकसित करना एक चुनौतीपूर्ण कार्य है। विभिन्न दृष्टिकोणों को रोजगार के बाद, हम निष्कर्ष निकाला है कि एक 3 डी गोलाभ मॉडल अधिक व्यावहारिक, श…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम BM2 और lebein-1 की तैयारी में बारबरा Schedding की मदद स्वीकार करते हैं. हम गोलाभ परख में अपनी विशेषज्ञता साझा करने के लिए $gnes नोएल स्वीकार करते हैं. हम S2 शर्तों के तहत lentiviral transfection से निपटने में उनकी मदद के लिए सोनिया Schelhaas और माइकल Sch$fers धन्यवाद. हम अग्नाशय के कैंसर के ऊतकों से CAFs तैयार करने में सबीन वॉन R$den की सहायता स्वीकार करते हैं.
इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान को यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम FP7/2007-2013/ के पीपुल्स प्रोग्राम (मैरी क्यूरी एक्शन्स) से आरईए अनुदान समझौते एन जेड (316610) से जेएई को वित्त पोषण प्राप्त हुआ है। इसके अलावा, जे.ए.ई. और ए.सी.एम.सी. को सेल-इन-मोशन क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस (EXC 1003-CiM) के भीतर ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। इस परियोजना को विल्हेम सैंडर स्टिफटंग (अनुदान: 2016.113.1 से जे.ए.ई.) द्वारा भी समर्थित किया गया था।
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
Referências
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?. Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
- Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
- Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
- Martins Cavaco, ., C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
- Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
- Goldberg, M. T., Han, Y. -. P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
- Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
- Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
- Huang, C. -. C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
- Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
- Makizumi, R., Yang, W. -. L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
- Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
- Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
- Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
- Lin, R. -. Z., Lin, R. -. Z., Chang, H. -. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).
