الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج 3D في المختبر لدراسة التمايز بين الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) في بيئة تشبه الورم السائبة، والتي يمكن معالجتها في أنظمة التحليل المختلفة، مثل الفلورة المناعية، النسخ التحليل وتصوير خلايا الحياة.
تحديد النموذج المثالي لدراسة في المختبر أمر ضروري، أساسا إذا دراسة العمليات الفسيولوجية مثل تمايز الخلايا. في ستروما الورم ، يتم تحفيز الخلايا الليفية المضيفة بواسطة الخلايا السرطانية للتمييز. وهكذا، فإنها تكتسب النمط الظاهري الذي يساهم في البيئة الدقيقة الورم ويدعم تطور الورم. باستخدام نموذج spheroid، قمنا بإعداد مثل هذا النظام نموذج 3D في المختبر، الذي قمنا بتحليل دور لامينين-332 ومستقبلات integrin α3β1 في هذه العملية التمايز. هذا النظام نموذج spheroid ليس فقط يستنسخ ظروف البيئة الدقيقة الورم بطريقة أكثر دقة، ولكن أيضا هو نموذج تنوعا جدا لأنه يسمح دراسات المصب مختلفة، مثل تلطيخ الفلورسنت المناعي من داخل وخارج الخلية على حد سواء علامات، فضلا عن البروتينات مصفوفة خارج الخلية المودعة. وعلاوة على ذلك، يمكن دراسة التحليلات النسخية التي أجراها qPCR، وقياس التدفق الخلوي والغزو الخلوي مع هذا النموذج. هنا، ونحن نصف بروتوكول من نموذج spheroid لتقييم دور integrin CAFs ‘α3β1 والرباط المودعة بشكل ectopically، لامينين-332، في التمايز وفي دعم غزو خلايا سرطان البنكرياس.
البيئة الدقيقة الورم هو محراب معقدة جدا ومهمة للغاية للحفاظ على وتطور الخلايا السرطانية1. يتم تشكيلها ليس فقط من الخلايا السرطانية ولكن أيضا من قبل الخلايا الليفية سترومال. وتحيط الخلايا السرطانية من قبل ستروما التي هي محددة ومختلفة عن ستروما من الأنسجة العادية2. Laminin-332 هو بروتين مصفوفة خارج الخلية أعرب عنها في ستروما من الأورام المختلفة، مثل سرطان الغدة الدرقية البنكرياس3. وعلاوة على ذلك، فإن التركيب البيوكيميائي لـ ECM وخصائصه البيوفيزيائية، مثل التصلب والتوتر، تتغير داخل الجزء الأكبر من الورم4. هذا الورم ستروما، أو “ستروما رد الفعل”، هو سبب التكيف من الخلايا الليفية إلى الخلايا السرطانية المجاورة وعن طريق تجنيد لاعبين آخرين مهمين جدا أن تطوير بيئة مواتية وداعمة لتقدم الورم. يؤدي تمايز الخلايا الليفية السترومالية إلى الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF). ويمكن تحديد هذه الخلايا باستخدام علامات مختلفة مثل α-الأكتين العضلات الملساء (αSMA)5 أو مستضد العصبية / glial 2 (NG2)6.
من الصعب تحديد النموذج الأكثر ملاءمة في المختبر لتلخيص البيئة الدقيقة للورم (TME) مع CAFs. ويجب النظر في طريقة محاكاة البارامترات الفسيولوجية للآلية بطريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للاستنساخ من أجل نظام نموذجي من هذا القبيل. وفي إطار هذه القطاعات، تحدث عمليات مختلفة، مثل الانتشار والتمايز والهجرة وغزو أنواع الخلايا المختلفة. ويمكن تنفيذ هذه العمليات الخلوية بشكل فردي بطرق مختلفة. ومع ذلك، يجب أن تنظر الظروف التجريبية في التفاعلات الخلوية مع الورم ستروما ECM، لأن صلابة الطبقة التحتية تؤثر على عملية التمايز CAF. R.G. ويلز علقت على تأثير تصلب المصفوفة على سلوك الخلية وأبرز أن التنظيم الخلوي الهيكلي وحالة التمايز لوحظ في الخلايا المستزرعة في المختبر قد تكون artefactual7. ويبدو أن المحفزات المختلفة تشارك في التمايز CAF، بما في ذلك التوتر الميكانيكي5،7. لتجنب هذا، يمكن أن تكون ركائز لينة 2D النهج الممكنة لدراسات التمايز، لأنها تتحايل على مشكلة البلاستيك طبق ثقافة قاسية. سطح 2D لينة، والتي يمكن أن تزرع الخلايا الليفية، يمكن أن يكون الكولاجين-I المغلفة هلام بولياكريلاميد، حيث يمكن التلاعب صلابة هلام من قبل تركيز polyacrylamide وهلام عبر linker. يتم تعزيز التصاق وتشكيل ألياف الإجهاد الغنية αSMA في الخلايا الليفية جنبا إلى جنب مع صلابة هلام8. وتؤكد هذه النتائج على أهمية السقالات الركيزة لينة لمزيد من النماذج الفسيولوجية في المختبر التمايز. ومع ذلك، في أيدينا كان استنساخ التجريبية والتصوير من هذه المواد الهلامية تحديا. للتغلب على أوجه القصور هذه، قمنا بتغيير نظام الركيزة الناعمة 2D لنموذج spheroid 3D لدراسات التمايز والغزو. هذا النموذج هو أكثر أهمية سريريا، وعلى غرار الجهازية في المختبر، يلخص في تفاعلات الخلايا الحية، إنتاج ECM والترسيب، فضلا عن سلوك الخلية9.
تتشكل النضدة عندما تفتقر الخلايا إلى الركيزة للتقيد بها. عندما تترك الخلايا دون سطح لاصق، فإنها تتجمع لتشكيل بنية كروية أكثر أو أقل. إذا كانت الـ spheroids تتكون من نوع واحد من الخلايا، فهي تسمى homospheroids. إذا كانت تتألف من نوعين أو أكثر من أنواع الخلايا المختلفة التي تشكل heterospheroids.
من بين الطرق المختلفة لإعداد spheroid، ونحن تنفيذ البروتوكول باستخدام غير الملتصقة جولة أسفل 96-جيدا لوحات. وهو فعال جدا فيما يتعلق بالتكاليف. هنا، ونحن ننتج كل من homospheroids من الخلايا الليفية، CAF أو CAFs تفتقر إلى integrin α3 الوحدة الفرعية لدراسة عملية التمايز وheterospheroids من CAFs أو integrin α3 KO CAFs وخلايا سرطان القناة البنكرياسية (AsPC-I وPANC-I) لدراسة الغزو في المصفوفة المحيطة.
وكان الهدف من هذه الدراسات هو استخدام الـ CAFs الأولية المعزولة عن الخزعات السرطانية البنكرياسية البشرية. ومع ذلك، فإن الخزعات للحصول على الخلايا نادرة ولهذا السبب، تم خلد CAFs المستخدمة في هذه الدراسات باستخدام فيروس العدس الذي يحتوي على HTERT. وتسمى iCAFs، ونظيراتها العادية، الخلايا الليفية البنكرياس البشرية الأولية، وتسمى iNFs. تتوفر الخلايا الليفية البنكرياسية البشرية وخلايا سرطان القناة البنكرياسية، AsPC-I وPANC-I، تجارياً.
تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة تأثير التفاعل اللامينين-332-integrin في عملية التمايز CAF. لإثبات خصوصية هذا التفاعل ووظيفته، تم استخدام مركبات مثبطة: BM2، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة يمنع موقع الربط integrin سلسلة اللامينين-332 α310،أو lebein 1، وهو مركب مشتق من سم الأفعى الذي يمنع لامينين ملزمة integrins α3β1، α6β1 وα7β111،12.
وبالنسبة لـ “فحص الغزو”، تم نقل الخلايا باستخدام فيروس اللينالذي يحتوي على ترميز الحمض النووي (iCAFs) (iCAFs وintegrin α3 KO iCAFs) أو GFP (AsPC-I وPANC-I) للتمييز بين أنواع الخلايا المختلفة في الهيتروسفيرويدات. يتم وصف تحويل الخلايا لتخليدها و / أو لتسميتها ببروتين الفلورسنت (mCherry و GFP) التعبير في دراسة سابقة13، التي ينبغي استشارتها للحصول على مزيد من المعلومات.
تطوير نموذج مناسب في المختبر لدراسة التمايز CAF مهمة صعبة. بعد استخدام نهج مختلفة، خلصنا إلى أن نموذج spheroid 3D هو النموذج الأكثر عملية، الفسيولوجية والسريرية ذات الصلة، والتي يمكن دراسة التفاعل بين خلايا سرطان البنكرياس مع CAFs خالدة. منع هذا النموذج التمايز التلقائي للخلايا الليفية، وذلك بسب…
The authors have nothing to disclose.
نحن نعترف بمساعدة باربرا شيدينج في إعداد BM2 وlebein-1. نحن نعترف بـ (أجينس نويل) لتقاسم خبرتها في التجارب نشكر سونيا شيلهاس ومايكل شيفرز على مساعدتهما في التعامل مع التغوط في المعمرة في ظل ظروف S2. نحن نعترف بإصرار سابين فون ردين في إعداد الـ CAFs من أنسجة سرطان البنكرياس.
وقد تلقى البحث الذي أدى إلى هذه النتائج تمويلا من برنامج الشعب (إجراءات ماري كوري) من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي FP7/2007-2013/ بموجب اتفاق منحة REA n… (316610) إلى J.A.E. وعلاوة على ذلك، تلقى كل من شركة J.A.E. وA.C.M.C. دعماً مالياً من قبل وزارة المالية الألمانية في إطار مجموعة الامتياز للخلايا المتحركة (EXC 1003-CiM). كما تم دعم هذا المشروع من قبل فيلهلم ساندر ستيفتونغ (منحة: 2016.113.1 إلى J.A.E.).
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
Dnase I | Roche | 10104159001 | |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
Incubator | Heraeus | B6060 | |
Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |