El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.
Definir el modelo ideal para un estudio in vitro es esencial, principalmente si se estudian procesos fisiológicos como la diferenciación de células. En el estroma tumoral, los fibroblastos del huésped son estimulados por las células cancerosas para diferenciarse. Por lo tanto, adquieren un fenotipo que contribuye al microambiente tumoral y apoya la progresión tumoral. Mediante el uso del modelo de esferoides, hemos configurado un sistema de modelo 3D in vitro, en el que analizamos el papel de laminina-332 y su receptor integrador n.o 3-1 en este proceso de diferenciación. Este sistema modelo esferoide no sólo reproduce las condiciones tumorales de microambiente de una manera más precisa, sino que también es un modelo muy versátil ya que permite diferentes estudios aguas abajo, como la tinción inmunofluorescente tanto intra- como extracelular marcadores, así como proteínas de matriz extracelular depositadas. Además, los análisis transcripcionales por qPCR, citometría de flujo e invasión celular se pueden estudiar con este modelo. Aquí, describimos un protocolo de un modelo esferoide para evaluar el papel de la integrina de los CAFs n.o 3-1 y su ligando depositado ectopáticamente, laminina-332, en la diferenciación y en el apoyo a la invasión de células cancerosas de páncreas.
El microambiente tumoral es un nicho muy complejo y extremadamenteimportante para el mantenimiento y la progresión de las células tumorales 1. Se forma no sólo por las células cancerosas, sino también por los fibroblastos estromales. Las células tumorales están rodeadas por un estroma quees específico y diferente del estroma de los tejidos normales 2. Laminin-332 es una proteína de matriz extracelular expresada ectópicamente en el estroma de diferentes tumores, como el adenocarcinoma pancreático3. Además, la composición bioquímica del ECM y también sus propiedades biofísicas, comola rigidez y la tensión, cambian dentro del tumor a granel 4. Este estroma tumoral, o “estroma reactivo”, es causado por una adaptación de fibroblastos a las células cancerosas vecinas y por el reclutamiento de otros actores muy importantes que desarrollan un ambiente favorable y de apoyo para la progresión tumoral. La diferenciación de los fibroblastos estromales da como resultado fibroblastos asociados al cáncer (CAF). Estas células se pueden identificar utilizando diferentes marcadores, como la actina muscular lisa (SMA)5 o el antígeno neural/glial 2 (NG2)6.
Es difícil seleccionar el modelo in vitro más adecuado para recapitular el microambiente tumoral (TME) con CAF. El método para imitar los parámetros fisiológicos del TME de una manera rentable y reproducible debe ser considerado para un sistema modelo de este tipo. Dentro del TME, se producen diferentes procesos, como la proliferación, diferenciación, migración e invasión de los diferentes tipos de células. Estos procesos celulares se pueden realizar individualmente con diferentes métodos. Sin embargo, las condiciones experimentales deben considerar las interacciones celulares con el eCM estroma tumoral, ya que la rigidez del sustrato influye en el proceso de diferenciación CAF. R.G. Wells comentó sobre el impacto de la rigidez de la matriz en el comportamiento celular y destacó que la organización citoesquelética y el estado de diferenciación observados en células cultivadas in vitro podrían ser artefactofactuales7. Diferentes estímulos parecen estar involucrados en la diferenciación CAF, incluyendo la tensión mecánica5,7. Para evitar esto, los sustratos blandos 2D podrían ser posibles enfoques para los estudios de diferenciación, ya que eluden el problema del plástico de la placa de cultivo rígido. Una superficie 2D suave, en la que se pueden cultivar fibroblastos, puede ser geles de poliacrilamida recubiertos de colágeno I, por lo que la rigidez del gel puede ser manipulada por la concentración de poliacrilamida y el retigente de gel. La adhesión y la formación de fibras de tensión ricas enSMA se potencian en fibroblastos junto con la rigidez del gel 8. Estos resultados subrayan la importancia de los andamios de sustrato blando para modelos de diferenciación in vitro más fisiológicas. Sin embargo, en nuestras manos la reproducibilidad experimental y la imagen de estos geles eran un reto. Para superar estas deficiencias, cambiamos el sistema de sustrato suave 2D por un modelo de esferoides 3D para estudios de diferenciación e invasión. Este modelo es más relevante desde el momento clínica y, al igual que un organoide in vitro, recapitulalas interacciones in vivo de células celulares, la producción y deposición de ECM, así como el comportamiento celular 9.
Los esferoides se forman cuando las células carecen de un sustrato al que adherirse. Cuando las células se quedan sin una superficie adhesiva, se agregan para formar una estructura más o menos esférica. Si los esferoides se componen de un tipo de célula, se llaman homoesferoides; si se compone de dos o más tipos de células diferentes que forman heterospheroids.
Entre los diferentes métodos para la preparación de esferoides, realizamos el protocolo utilizando placas de fondo inferior de 96 pocillos no adherentes. Es muy eficaz con respecto a los costes. Aquí, producimos tanto homoesferoides de fibroblastos, CAF o HCA que carecen de la subunidad integrina n.o 3 para examinar el proceso de diferenciación y los heteroesferoides de los CAF o la integrina 3 KO HCA y las células del carcinoma de conductopante (AsPC-I y PANC-I) para estudiar la invasión en la matriz circundante.
El objetivo de estos estudios era utilizar CAF primarios aislados de biopsias de carcinoma pancreático humano. Sin embargo, las biopsias para obtener las células son escasas y por esta razón, los CAC utilizados en estos estudios han sido inmortalizados utilizando lentivirus que contiene HTERT. Se llaman iCIF, y sus homólogos normales, los fibroblastos pancreáticos humanos primarios, se denominan iNF. Los fibroblastos pancreáticos humanos y las células del carcinoma del conducto pancreático, AsPC-I y PANC-I, están disponibles comercialmente.
Este protocolo se utilizó para estudiar el efecto de la interacción laminina-332-integrina en el proceso de diferenciación CAF. Para probar la especificidad de esta interacción y su función, se utilizaron compuestos inhibidores: BM2, un anticuerpo monoclonal que bloquea el sitio de unión de integrina de la cadena laminina-332 x 310,o lebeina 1, un compuesto derivado del veneno de serpiente que bloquea el integrinas de laminina 3o1, 6o1 y 7o111,12.
Para el ensayo de invasión, las células habían sido transducidas con lentivirus que contenían cDNA codificando mCherry (iCIF y integrin a 3 KO iCFÁs) o GFP (AsPC-I y PANC-I) para distinguir los diferentes tipos de células en los heteroesferoides. La transducción de las células para inmortalizarlas y/o etiquetarlas con expresión de proteína fluorescente (mCherry y GFP) se describe en un estudio anterior13,que debe ser consultado para más información.
Desarrollar un modelo in vitro adecuado para estudiar la diferenciación CAF es una tarea difícil. Después de emplear diferentes enfoques, llegamos a la conclusión de que un modelo de esferoides 3D es el modelo más práctico, fisiológico y clínicamente relevante, en el que se puede estudiar la interacción entre células de carcinoma pancreático con CAF inmortalizados. Este modelo previno la diferenciación espontánea de fibroblastos, debido a factores de estrés artefactosfásicos como la rigidez del plástico d…
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos la ayuda de Barbara Schedding en la preparación del BM2 y el lebein-1. Reconocemos a Gnes Noel por compartir su experiencia en ensayos esferoides. Agradecemos a Sonja Schelhaas y Michael Sch-fers por su ayuda en el manejo de la transfección lentiviral bajo condiciones S2. Reconocemos la asistencia de Sabine von R-den en la preparación de los CAF a partir del tejido de cáncer de páncreas.
La investigación que ha llevado a estos resultados ha recibido financiación del Programa de Personas (Marie Curie Actions) del Séptimo Programa Marco FP7/2007-2013 de la Unión Europea/ en virtud del acuerdo de subvención rea (316610) a J.A.E. Además, J.A.E. y A.C.M.C. contaron con el apoyo financiero de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro del Clúster de Excelencia de Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Este proyecto también fue apoyado por Wilhelm Sander Stiftung (subvención: 2016.113.1 a J.A.E.).
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
Dnase I | Roche | 10104159001 | |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
Incubator | Heraeus | B6060 | |
Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |