Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello in vitro 3D per studiare la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro (CAF) in un ambiente di massa tumorale, che può essere affrontato in diversi sistemi di analisi, come l’immunofluorescenza, la trascrizione l’analisi e l’imaging delle cellule di vita.
Abstract
Definire il modello ideale per uno studio in vitro è essenziale, soprattutto se si studiano i processi fisiologici come la differenziazione delle cellule. Nello stroma tumorale, i fibroblasti ospiti sono stimolati dalle cellule tumorali per differenziarsi. Così, acquisiscono un fenotipo che contribuisce al microambiente tumorale e supporta la progressione del tumore. Utilizzando il modello sferoide, abbiamo istituito un tale sistema di modelli in vitro 3D, in cui abbiamo analizzato il ruolo della laminina-332 e il suo recettore integrin n. 31 in questo processo di differenziazione. Questo sistema di modelli sferoidi non solo riproduce le condizioni del microambiente tumorale in modo più accurato, ma è anche un modello molto versatile in quanto consente diversi studi a valle, come la colorazione immunofluorescente di entrambi gli intra che extracellulari marcatori, così come le proteine della matrice extracellulare depositate. Inoltre, le analisi trascrizionali di qPCR, la citometria di flusso e l’invasione cellulare possono essere studiate con questo modello. Qui, descriviamo un protocollo di un modello sferoide per valutare il ruolo dell’integro dei CAF n. 31 e il suo ligando depositato ectopicamente, laminina-332, nella differenziazione e nel sostenere l’invasione delle cellule tumorali del pancreas.
Introduction
Il microambiente tumorale è una nicchia molto complessa ed estremamente importante per il mantenimento e la progressione delle cellule tumorali1. È formato non solo dalle cellule tumorali, ma anche dai fibroblasti stromici. Le cellule tumorali sono circondate da uno stroma specifico e diverso dallo stroma dei tessuti normali2. Laminin-332 è una proteina matrice extracellulare ectopicamente espressa nello stroma di diversi tumori, come l’adenocarcinoma pancreatico3. Inoltre, la composizione biochimica dell’ECM e anche le sue proprietà biofisiche, come rigidità e tensione, cambiano all’interno della massa tumorale4. Questo stroma tumorale, o “stroma reattivo”, è causato da un adattamento dei fibroblasti alle cellule tumorali vicine e dal reclutamento di altri giocatori molto importanti che sviluppano un ambiente favorevole e favorevole per la progressione del tumore. La differenziazione dei fibroblasti stromali provoca fibroblasti associati al cancro (CAF). Queste cellule possono essere identificate utilizzando diversi marcatori come actin muscolare sleale (SMA)5 o antigene neurale/gliale 2 (NG2)6.
Il modello in vitro più adatto per ricapitolare il microambiente tumorale (TME) con I CAF è difficile da selezionare. Il metodo per imitare i parametri fisiologici del TME in modo efficiente in termini di costi e riproducibile deve essere considerato per un tale sistema modello. All’interno del TME, si verificano diversi processi, come la proliferazione, la differenziazione, la migrazione e l’invasione dei diversi tipi di cellule. Questi processi cellulari possono essere eseguiti singolarmente con diversi metodi. Tuttavia, le condizioni sperimentali devono considerare le interazioni cellulari con il tumore stroma ECM, poiché la rigidità del substrato influenza il processo di differenziazione CAF. R.G. Wells ha commentato l’impatto della rigidità della matrice sul comportamento cellulare e ha evidenziato che l’organizzazione citoscheletrica e lo stato di differenziazione osservati nelle cellule coltivate in vitro potrebbero essere artefattuale7. Diversi stimoli sembrano essere coinvolti nella differenziazione CAF, tra cui tensione meccanica5,7. Per evitare questo, i substrati morbidi 2D potrebbero essere possibili approcci per gli studi di differenziazione, in quanto eludono il problema della plastica piatto di coltura rigida. Una superficie 2D morbida, su cui possono essere coltivati fibroblasti, può essere gel in poliacrilammide rivestiti di collagene,I, per cui la rigidità del gel può essere manipolata dalla concentrazione di poliacrilammide e dal paralinker ad gel. L’adesione e la formazione di fibre da stress ricche di SMA sono esaltate nei fibroblasti insieme alla rigidità del gel8. Questi risultati sottolineano l’importanza degli scaffold di substrato morbido per modelli di differenziazione in vitro più fisiologici. Tuttavia, nelle nostre mani la riproducibilità sperimentale e l’imaging di questi gel erano impegnativi. Per superare queste carenze, abbiamo cambiato il sistema di substrato morbido 2D per un modello di sferoide 3D per gli studi di differenziazione e invasione. Questo modello è più clinicamente rilevante e, simile a un organoide in vitro, riassume in vivo le interazioni cellula-cellula, la produzione e la deposizione di ECM, nonché il comportamento cellulare9.
Gli sferoidi si formano quando le cellule non hanno un substrato a cui aderire. Quando le cellule vengono lasciate senza una superficie adesiva, si aggregano per formare una struttura più o meno sferica. Se gli sferoidi sono composti da un tipo di cellula, sono chiamati omospheroidi; se composti da due o più tipi di cellule diverse formano eterospheroidi.
Tra i diversi metodi per la preparazione degli sferoidi, eseguiamo il protocollo utilizzando piastre di 96 pozze di fondo rotonde non aderenti. È molto efficace per quanto riguarda i costi. Qui produciamo sia omospheroidi di fibroblasti, CAF o CAF privi della sottounità integrin n. 3 per esaminare il processo di differenziazione e gli eterospheroidi dei CAF o integrin, ovvero LE CAF e le cellule carcinoma pancreatiche (AsPC-I e PANC-I) per studiare l’invasione nella matrice circostante.
L’obiettivo di questi studi era quello di utilizzare CAF primari isolati dalle biopsie del carcinoma pancreatico umano. Tuttavia, le biopsie per ottenere le cellule sono scarse e per questo motivo, i CAF utilizzati in questi studi sono stati immortalati utilizzando lentivirus contenente HTERT. Sono chiamati iCAIf, e le loro controparti normali, fibroblaste pancreatiche umane primarie, sono chiamate iNF. I fibroblasti pancreatici umani e le cellule carcinomiche del condotto pancreatico, AsPC-I e PANC-I, sono disponibili in commercio.
Questo protocollo è stato utilizzato per studiare l’effetto dell’interazione laminina-332-integrin nel processo di differenziazione CAF. Per dimostrare la specificità di questa interazione e della sua funzione, sono stati utilizzati composti inibitori: BM2, un anticorpo monoclonale che blocca il sito di legame integrin i lamini lamin-33 catena10, o lebein1, un composto derivato dal veleno di serpente che blocca il integrins leganti alla laminina : 3 , 1 , 1 e 7 ,11,12.
Per il saggio di invasione, le cellule erano state tradusse con lentivirus contenente la codifica cDNA o mCherry (iCAF e iCAF) o GFP integr (AsPC-I e PANC-I) per distinguere i diversi tipi di cellule negli eterospheroids. La trasduzione delle cellule per immortalarle e/o per etichettarle con espressione di proteina fluorescente (mCherry e GFP) è descritta in uno studio precedente13, che dovrebbe essere consultata per ulteriori informazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sviluppare un modello in vitro appropriato per studiare la differenziazione CAF è un compito impegnativo. Dopo aver impiegato approcci diversi, abbiamo concluso che un modello sferoide 3D è il modello più pratico, fisiologico e clinicamente rilevante, in cui è possibile studiare l’interazione tra le cellule carcinoma pancreatiche con CAF immortalati. Questo modello ha impedito la differenziazione spontanea dei fibroblasti, a causa di fattori di stress artefattuali come la rigidità della coltura cellulare plastica, a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo l’aiuto di Barbara Schedding nella preparazione del BM2 e del lebein-1. Riconosciamo che il signor Noel è stato condiviso per aver condiviso la sua esperienza nei saggi sferoidi. Ringraziamo Sonja Schelhaas e Michael Schafers per il loro aiuto nella gestione della trasfezione lentivirale in condizioni Di S2. Riconosciamo l’assistenza di Sabine von Ràden nella preparazione di CAF dal tessuto tuscitico.
La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Programma Persone (Azioni Marie Curie) del settimo programma quadro dell’Unione europea FP7/2007-2013/ in base all’accordo di sovvenzione REA n. (316610) a J.A.E. Inoltre, J.A.E. e A.C.M.C. sono stati sostenuti finanziariamente dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) all’interno del Cluster di Eccellenza Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Questo progetto è stato sostenuto anche da Wilhelm Sander Stiftung (sovvenzione: 2016.113.1 a J.A.E.).
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
Referências
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