70% आंशिक हेपेटेक्टोमी और एसीटामिनोफेन के संयोजन से तीव्र यकृत विफलता के चूहे मॉडल की पीढ़ी
Summary
वर्तमान अध्ययन में विकसित तीव्र जिगर विफलता पशु मॉडल संभावित उपचारों के अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रस्तुत करता है । वर्तमान मॉडल शारीरिक और नशीली दवाओं से प्रेरित हेपेटिक चोट के संयुक्त प्रभाव को रोजगार और उपन्यास चिकित्सा की क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त समय खिड़की प्रदान करता है ।
Abstract
एक्यूट लिवर फेलियर (एएलएफ) एक नैदानिक स्थिति है जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न एटिओलोजी होते हैं जिसके परिणामस्वरूप मेटाबोलिक, बायोकेमिकल, संश्लेषण और यकृत के डिटॉक्सिफाइंग कार्यों का नुकसान होता है। सबसे अपरिवर्तनीय जिगर क्षति के मामलों में, ऑर्थोट्रोपिक लिवर प्रत्यारोपण (OLT) केवल उपलब्ध उपचार रहता है । ALF के लिए एक उपचार की चिकित्सीय क्षमता का अध्ययन करने के लिए, ALF के एक पशु मॉडल में इसका पूर्व परीक्षण आवश्यक है । वर्तमान अध्ययन में, चूहों में एक एएलएफ मॉडल 70% आंशिक हेपेटेक्टोमी (पीएचएक्स) और एसीटामिनोफेन (एपीएपी) के इंजेक्शन के संयोजन से विकसित किया गया था जो 48 एच की चिकित्सीय खिड़की प्रदान करता है। जिगर के औसत और बाएं पार्श्व पालि को लिवर द्रव्यमान का 70% उत्पाद करने के लिए हटा दिया गया था और एपीएपी को 2 दिनों के लिए 24 घंटे पोस्टसर्जिकल दिया गया था। एएलएफ-प्रेरित जानवरों में अस्तित्व में गंभीर रूप से कमी पाई गई । एएलएफ के विकास की पुष्टि एंजाइमों के परिवर्तित सीरम स्तर से हुई थी, जो एलेनिन अमीनो ट्रांसफरेज़ (एएलटी), एस्पार्टेट अमीनो ट्रांसफरेज़ (एसीटी), क्षारीय फॉस्फेटेज (एएलपी); प्रोथ्रोबिन समय (पीटी) में परिवर्तन; और अंतर्राष्ट्रीय सामान्यीकृत अनुपात (आईएनआर) का मूल्यांकन। क्यूपीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के अध्ययन से एपोप्टोसिस, सूजन और यकृत की चोट की प्रगति में शामिल जीन के अभिव्यक्ति स्तर में वृद्धि का पता चला। हेपेटोसाइट्स का डिजास्टर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन द्वारा देखी गई थी। एएलएफ की रिवर्सिबिलिटी की पुष्टि सिंजेनिक स्वस्थ चूहे हेपेटोसाइट्स के इंट्रास्पलिक प्रत्यारोपण के बाद एएलटी, एसीटी और एएलपी के अस्तित्व और सीरम स्तर की बहाली से हुई थी। यह मॉडल एएलएफ के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के साथ-साथ एएलएफ के लिए एक उपन्यास चिकित्सा की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपलब्ध एएलएफ पशु मॉडल के लिए एक विश्वसनीय विकल्प प्रस्तुत करता है। दो अलग-अलग दृष्टिकोणों का उपयोग शारीरिक और दवा-प्रेरित यकृत चोट के संयुक्त प्रभाव का अध्ययन करना भी संभव बनाता है। वर्तमान प्रक्रिया की प्रजनन क्षमता और व्यवहार्यता मॉडल का एक अतिरिक्त लाभ है।
Introduction
तीव्र जिगर की विफलता (ALF) को अमेरिकन एसोसिएशन फॉर द स्टडी फॉर द स्टडी फॉर लिवर डिजीज द्वारा क्षति के किसी भी पूर्व संकेत के बिना तीव्र यकृत चोट के तेजी से विकास के रूप में परिभाषित किया गया है और यह जिगरकेसिंथेटिक, मेटाबोलिक और विषहरण कार्यों की गंभीर हानि की विशेषता है। एएलएफ पुरानी यकृत विफलता से अलग होता है जहां विफलता लंबे समय तक और तीव्र पुरानी यकृत विफलता (एसीएलएफ) से होती है, जहां पुरानी यकृत बीमारियों2,3,4के परिणामस्वरूप अचानक यकृत क्षति होती है। एएलएफ के लिए एकमात्र उपलब्ध इलाज ऑर्थोटोपिक लिवर ट्रांसप्लांट (ओएलटी) है, या मौत हो सकती है। लिवर डोनर्स की कमी के कारण एएलएफ से पीड़ित मरीजों में मृत्यु दर काफी ज्यादा है।
वैकल्पिक चिकित्सीय दृष्टिकोणों की क्षमता का अध्ययन करने और एएलएफ के रोगविज्ञान को बेहतर ढंग से समझने के लिए, पशु मॉडल जो मनुष्यों में होने वाले एएलएफ को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, की आवश्यकता है। पहले से उपलब्ध एएलएफ पशु मॉडल ों में से कई में कई कमियां हैं। एसीटामिनोफेन (एपीएपी) प्रभाव प्रजनन करना मुश्किल है लेकिन लौकिक, नैदानिक, जैव रासायनिक और रोग मापदंडों के मामले में निकटतम समानताएं हैं। एपीएपी द्वारा हीमोग्लोबिन के ऑक्सीकरण और इसके मध्यवर्ती5,6,7के कारण मेथोग्लोबिनमिया की उपस्थिति के कारण एपीएपी प्रेरित पशु मॉडल अक्सर समस्याओं का सामना करते हैं । एक और समस्या अप्रत्याशित खुराक प्रतिक्रियाओं और मृत्यु के समय से परिलक्षित प्रजनन क्षमता की कमी है। कार्बन टेट्रा क्लोराइड (सीसीएल4)का उपयोग करके उत्पादित एएलएफ पशु मॉडलों में खराब प्रजनन क्षमता8,9,10,11है । Concavalin A (कांग्रेस ए) और लिपोपलिसैक्हरिड (एलपीएस) प्रेरित एएलएफ पशु मॉडल मानव रोग के नैदानिक पैटर्न को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, हालांकि उन्हें ऑटोइम्यून यकृत रोगों में शामिल सेलुलर तंत्र के अध्ययन में और सेप्सिस के अध्ययन में क्रमशः12,13,14,15के फायदे हैं। इसी तरह, थिओएसेटामाइड (टीएए) को भी एक सक्रिय मेटाबोलाइट थियोएसेटामाइड सल्फासऑक्साइड में बायोट्रांसफॉर्मेशन की आवश्यकता होती है और प्रजातियों की भिन्नता16,17,18,19को दर्शाती है। डी-गैलेक्टोसामाइन (डी-गल) एएलएफ के समान कुछ जैव रासायनिक, मेटाबोलिक और शारीरिक परिवर्तन पैदा करता है लेकिन पूरे एएलएफ रोग की स्थिति20,21,22,23को प्रतिबिंबित करने में सक्षम नहीं है। एएलएफ मॉडल विकसित करने के लिए इनमें से दो या अधिक तरीकों को मिलाने के बहुत कम प्रयास किए गए हैं जो एएलएफ सिंड्रोम को बेहतर तरीके सेप्रतिबिंबितकरने में सक्षम है । इसलिए, आगे के अध्ययनके लिए एक मॉडल है कि रोग मापदंडों को प्रतिबिंबित कर सकते है विकसित करने के लिए आवश्यक हैं, बेहतर प्रजनन क्षमता है, और एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करता है ।
वर्तमान अध्ययन में, आंशिक हेपेटेक्टोमी (पीएचएक्स) के प्रभाव और हेपेटोटॉक्स रिएजेंट की कम खुराक के संयोजन से चूहों में एक वैकल्पिक एएलएफ मॉडल बनाया गया है। एएपीएपी की लिवर इंजरी5,24,25को पैदा करने में अच्छी तरह से स्थापित भूमिका है । यह एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला एनाल्जेसिक है और जहरीले मेटाबोलाइट्स बनाकर सुप्राथेराप्यूटिक खुराक पर जिगर के लिए विषाक्त है। एपीएपी विकसित देशों में कई मौतों का कारण है । आंशिक हेपेटेक्टोमी के कारण शारीरिक चोट सूजन के साथ-साथ जिगर के उत्थान में शामिल विभिन्न प्रक्रियाओं की सक्रियता शुरू करती है। हेपेटोटॉक्सिक एजेंट एपीएपी का इंजेक्शन जिगर में शत्रुतापूर्ण वातावरण का कारण बनता है, जिससे हेपेटोसाइट्स के प्रसार को रोका जा सकता है। यह जानवर पर तनाव की अवधि को कम करता है, जो हेपेटोक्सिन की छोटी खुराक के साथ संयुक्त होने पर, प्रक्रिया की बेहतर प्रजनन क्षमता की ओर जाता है। इसलिए, इस मॉडल का उपयोग करके, दो प्रकार के यकृत चोटों के संयोजन प्रभाव का अध्ययन किया गया है। विकसित एएलएफ पशु मॉडल की विशेषता के लिए, शारीरिक और जैव रासायनिक मापदंडों का अध्ययन किया गया है। एएलएफ की सफल रिवर्सिबिलिटी की पुष्टि सिंजेनिक स्वस्थ चूहे हेपेटोसाइट्स के प्रत्यारोपण से हुई थी।
Protocol
Representative Results
Discussion
एएलएफ के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल का विकास रोगजनकता और एएलएफ की प्रगति की बेहतर समझ के लिए सर्वोपरि है। एक अच्छी तरह से विशेषता एएलएफ पशु मॉडल भी एएलएफ के खिलाफ नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों के विकास और परीक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को भारत सरकार के जैव प्रौद्योगिकी विभाग से राष्ट्रीय इम्यूनोलॉजी संस्थान नई दिल्ली को प्राप्त कोर ग्रांट ने समर्थन दिया।
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
