Generatie van een rat model van acuut leverfalen door het combineren van 70% partiële Hepatectomie en Acetaminophen
Summary
De acute leverfalen diermodel ontwikkeld in de huidige studie presenteert een haalbaar alternatief voor de studie van mogelijke therapieën. Het huidige model maakt gebruik van het gecombineerde effect van fysieke en drug-geïnduceerde leverschade en biedt een geschikte tijdvenster om het potentieel van nieuwe therapieën te bestuderen.
Abstract
Acuut leverfalen (ALF) is een klinische aandoening veroorzaakt door verschillende etiologieën resulterend in het verlies van metabole, biochemische, synthetiserende, en ontgiftende functies van de lever. In de meeste onherstelbare leverschade gevallen, orthotrope levertransplantatie (OLT) blijft de enige beschikbare behandeling. Om het therapeutische potentieel van een behandeling voor ALF te bestuderen, is de voorafgaande test in een dierlijk model van ALF essentieel. In de huidige studie, een ALF model bij ratten werd ontwikkeld door het combineren van 70% partiële hepatectomie (PHx) en injecties van paracetamol (APAP) die voorziet in een therapeutisch venster van 48 h. De mediane en linker laterale lobben van de lever werden verwijderd naar accijnzen 70% van de lever massa en APAP werd gegeven 24 h postoperatief gedurende 2 dagen. Overleving in door ALF geïnduceerde dieren bleek ernstig afgenomen te zijn. De ontwikkeling van ALF werd bevestigd door veranderde serumspiegels van de enzymen alanine amino Transferase (ALAT), aspartaat aminotransferase (AST), alkalische fosfatase (ALP); veranderingen in de protrombine tijd (PT); en de beoordeling van de internationale genormaliseerde ratio (INR). Onderzoek van het genexpressie profiel door qPCR onthulde een toename van de expressieniveaus van genen die betrokken zijn bij apoptosis, ontsteking en in de progressie van leverbeschadiging. Diffuse degeneratie van hepatocyten en infiltratie van immuuncellen werd waargenomen door histologische evaluatie. De reversibiliteit van ALF werd bevestigd door het herstel van de overleving en serum niveaus van ALT, AST en ALP na intrasplenische transplantatie van syngene gezonde rat hepatocyten. Dit model presenteert een betrouwbaar alternatief voor de beschikbare ALF diermodellen om de pathofysiologie van ALF te bestuderen en om het potentieel van een nieuwe therapie voor ALF te evalueren. Het gebruik van twee verschillende benaderingen maakt het ook mogelijk om het gecombineerde effect van lichamelijke en drug-geïnduceerde leverschade te bestuderen. De reproduceerbaarheid en haalbaarheid van de huidige procedure is een bijkomend voordeel van het model.
Introduction
Acuut leverfalen (ALF) wordt gedefinieerd door de Amerikaanse Vereniging voor de studie van leverziekten als snelle ontwikkeling van acute leverschade zonder enige voorafgaande tekenen van schade en wordt gekenmerkt door ernstige aantasting van de synthetische, metabole, en ontgiftende functies van de lever1. Alf verschilt van chronisch leverfalen waarbij de storing optreedt als gevolg van leverschade veroorzaakt gedurende een lange periode van tijd en van acuut chronisch leverfalen (aclf), waar abrupte leverschade plaatsvindt als gevolg van chronische leverziekten2,3,4. De enige beschikbare remedie voor ALF is orthotopic levertransplantatie (OLT), of de dood kan optreden. Vanwege het tekort aan lever donoren is het sterftecijfer bij patiënten met ALF zeer hoog.
Om het potentieel van alternatieve therapeutische benaderingen te bestuderen en om de pathofysiologie van ALF beter te begrijpen, zijn diermodellen nodig die het ALF kunnen weerspiegelen dat zich bij mensen voordoet. Veel van de reeds beschikbare ALF diermodellen hebben verschillende tekortkomingen. Acetaminophen (APAP) effecten zijn moeilijk te reproduceren, maar hebben de dichtstbijzijnde gelijkenissen in termen van temporele, klinische, biochemische, en pathologische parameters. APAP-geïnduceerde diermodellen ondervinden vaak problemen als gevolg van de aanwezigheid van methemoglobinemie veroorzaakt door de oxidatie van hemoglobine door APAP en haar tussen producten5,6,7. Een ander probleem is het gebrek aan reproduceerbaarheid dat wordt weerspiegeld door onvoorspelbare dosis responsen en de tijd van overlijden. De diermodellen van Alf die met koolstof Tetra chloride (CCL4) worden geproduceerd, hebben een slechte reproduceerbaarheidvan8,9,10en11. Concavalin a (CON a) en lipoplysaccharide (LPS)-geïnduceerde Alf diermodellen niet het klinische patroon van de ziekte van de mens weerspiegelen, hoewel ze voordelen in de studie van cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij auto-immune leverziekten en in de studie van sepsis respectievelijk12,13,14,15. Evenzo vereist thioacetamide (TAA) ook biotransformatie naar een actieve metaboliet thioacetamide sulfoxide en toont soorten variatie16,17,18,19. D-galactosamine (d-Gal) produceert sommige biochemische, metabole en fysiologische veranderingen vergelijkbaar met Alf maar is niet in staat om de hele Alf pathologische aandoening20,21,22,23weer te geven. Er zijn zeer weinig pogingen geweest om twee of meer van deze methoden te combineren om een ALF-model te ontwikkelen dat in staat is om het ALF-syndroom op een betere manier te reflecteren13. Daarom zijn verdere studies nodig om een model te ontwikkelen dat de parameters van de ziekte kan weerspiegelen, een betere reproduceerbaarheid heeft en voldoende tijd biedt om de effecten van een therapeutische interventie te bestuderen.
In de huidige studie, een alternatief ALF model bij ratten is gemaakt door het combineren van de effecten van gedeeltelijke hepatectomie (PHx) en lagere doses van een Hepatotoxische reagens. APAP heeft een gevestigde rol in het veroorzaken van leverschade5,24,25. Het is een veelgebruikte analgetische en is giftig voor de lever bij supratherapeutische doses door het vormen van toxische metabolieten. APAP is de oorzaak van vele sterfgevallen in ontwikkelde landen. Lichamelijk letsel veroorzaakt door gedeeltelijke hepatectomie initieert activering van verschillende processen die betrokken zijn bij ontstekingen en lever regeneratie. Injectie van de Hepatotoxische agent APAP veroorzaakt een vijandige omgeving in de lever, het voorkomen van de proliferatie van hepatocyten. Dit vermindert de stress periode op het dier, die in combinatie met kleinere doses hepatotoxine leidt tot een betere reproduceerbaarheid van de procedure. Daarom is het gebruik van dit model een combinatoir effect van twee soorten lever blessures bestudeerd. Om het diermodel van de ontwikkelde ALF te karakteriseren, zijn fysiologische en biochemische parameters bestudeerd. Succesvolle reversibiliteit van ALF werd bevestigd door transplantatie van syngene gezonde rat hepatocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ontwikkeling van een geschikt diermodel voor ALF is van het allergrootste belang voor een beter begrip van pathogenese en progressie van ALF. Een goed gekarakteriseerd ALF diermodel biedt ook de mogelijkheid voor de ontwikkeling en beproeving van nieuwe therapeutische benaderingen tegen ALF. Er zijn veel pogingen gedaan om een klinisch relevant model van Alf6,12,21,23,<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de kern subsidie van het departement biotechnologie, de regering van India, aan het Nationaal Instituut voor immunologie, New Delhi.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
