Summary
De acute leverfalen diermodel ontwikkeld in de huidige studie presenteert een haalbaar alternatief voor de studie van mogelijke therapieën. Het huidige model maakt gebruik van het gecombineerde effect van fysieke en drug-geïnduceerde leverschade en biedt een geschikte tijdvenster om het potentieel van nieuwe therapieën te bestuderen.
Abstract
Acuut leverfalen (ALF) is een klinische aandoening veroorzaakt door verschillende etiologieën resulterend in het verlies van metabole, biochemische, synthetiserende, en ontgiftende functies van de lever. In de meeste onherstelbare leverschade gevallen, orthotrope levertransplantatie (OLT) blijft de enige beschikbare behandeling. Om het therapeutische potentieel van een behandeling voor ALF te bestuderen, is de voorafgaande test in een dierlijk model van ALF essentieel. In de huidige studie, een ALF model bij ratten werd ontwikkeld door het combineren van 70% partiële hepatectomie (PHx) en injecties van paracetamol (APAP) die voorziet in een therapeutisch venster van 48 h. De mediane en linker laterale lobben van de lever werden verwijderd naar accijnzen 70% van de lever massa en APAP werd gegeven 24 h postoperatief gedurende 2 dagen. Overleving in door ALF geïnduceerde dieren bleek ernstig afgenomen te zijn. De ontwikkeling van ALF werd bevestigd door veranderde serumspiegels van de enzymen alanine amino Transferase (ALAT), aspartaat aminotransferase (AST), alkalische fosfatase (ALP); veranderingen in de protrombine tijd (PT); en de beoordeling van de internationale genormaliseerde ratio (INR). Onderzoek van het genexpressie profiel door qPCR onthulde een toename van de expressieniveaus van genen die betrokken zijn bij apoptosis, ontsteking en in de progressie van leverbeschadiging. Diffuse degeneratie van hepatocyten en infiltratie van immuuncellen werd waargenomen door histologische evaluatie. De reversibiliteit van ALF werd bevestigd door het herstel van de overleving en serum niveaus van ALT, AST en ALP na intrasplenische transplantatie van syngene gezonde rat hepatocyten. Dit model presenteert een betrouwbaar alternatief voor de beschikbare ALF diermodellen om de pathofysiologie van ALF te bestuderen en om het potentieel van een nieuwe therapie voor ALF te evalueren. Het gebruik van twee verschillende benaderingen maakt het ook mogelijk om het gecombineerde effect van lichamelijke en drug-geïnduceerde leverschade te bestuderen. De reproduceerbaarheid en haalbaarheid van de huidige procedure is een bijkomend voordeel van het model.
Introduction
Acuut leverfalen (ALF) wordt gedefinieerd door de Amerikaanse Vereniging voor de studie van leverziekten als snelle ontwikkeling van acute leverschade zonder enige voorafgaande tekenen van schade en wordt gekenmerkt door ernstige aantasting van de synthetische, metabole, en ontgiftende functies van de lever1. Alf verschilt van chronisch leverfalen waarbij de storing optreedt als gevolg van leverschade veroorzaakt gedurende een lange periode van tijd en van acuut chronisch leverfalen (aclf), waar abrupte leverschade plaatsvindt als gevolg van chronische leverziekten2,3,4. De enige beschikbare remedie voor ALF is orthotopic levertransplantatie (OLT), of de dood kan optreden. Vanwege het tekort aan lever donoren is het sterftecijfer bij patiënten met ALF zeer hoog.
Om het potentieel van alternatieve therapeutische benaderingen te bestuderen en om de pathofysiologie van ALF beter te begrijpen, zijn diermodellen nodig die het ALF kunnen weerspiegelen dat zich bij mensen voordoet. Veel van de reeds beschikbare ALF diermodellen hebben verschillende tekortkomingen. Acetaminophen (APAP) effecten zijn moeilijk te reproduceren, maar hebben de dichtstbijzijnde gelijkenissen in termen van temporele, klinische, biochemische, en pathologische parameters. APAP-geïnduceerde diermodellen ondervinden vaak problemen als gevolg van de aanwezigheid van methemoglobinemie veroorzaakt door de oxidatie van hemoglobine door APAP en haar tussen producten5,6,7. Een ander probleem is het gebrek aan reproduceerbaarheid dat wordt weerspiegeld door onvoorspelbare dosis responsen en de tijd van overlijden. De diermodellen van Alf die met koolstof Tetra chloride (CCL4) worden geproduceerd, hebben een slechte reproduceerbaarheidvan8,9,10en11. Concavalin a (CON a) en lipoplysaccharide (LPS)-geïnduceerde Alf diermodellen niet het klinische patroon van de ziekte van de mens weerspiegelen, hoewel ze voordelen in de studie van cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij auto-immune leverziekten en in de studie van sepsis respectievelijk12,13,14,15. Evenzo vereist thioacetamide (TAA) ook biotransformatie naar een actieve metaboliet thioacetamide sulfoxide en toont soorten variatie16,17,18,19. D-galactosamine (d-Gal) produceert sommige biochemische, metabole en fysiologische veranderingen vergelijkbaar met Alf maar is niet in staat om de hele Alf pathologische aandoening20,21,22,23weer te geven. Er zijn zeer weinig pogingen geweest om twee of meer van deze methoden te combineren om een ALF-model te ontwikkelen dat in staat is om het ALF-syndroom op een betere manier te reflecteren13. Daarom zijn verdere studies nodig om een model te ontwikkelen dat de parameters van de ziekte kan weerspiegelen, een betere reproduceerbaarheid heeft en voldoende tijd biedt om de effecten van een therapeutische interventie te bestuderen.
In de huidige studie, een alternatief ALF model bij ratten is gemaakt door het combineren van de effecten van gedeeltelijke hepatectomie (PHx) en lagere doses van een Hepatotoxische reagens. APAP heeft een gevestigde rol in het veroorzaken van leverschade5,24,25. Het is een veelgebruikte analgetische en is giftig voor de lever bij supratherapeutische doses door het vormen van toxische metabolieten. APAP is de oorzaak van vele sterfgevallen in ontwikkelde landen. Lichamelijk letsel veroorzaakt door gedeeltelijke hepatectomie initieert activering van verschillende processen die betrokken zijn bij ontstekingen en lever regeneratie. Injectie van de Hepatotoxische agent APAP veroorzaakt een vijandige omgeving in de lever, het voorkomen van de proliferatie van hepatocyten. Dit vermindert de stress periode op het dier, die in combinatie met kleinere doses hepatotoxine leidt tot een betere reproduceerbaarheid van de procedure. Daarom is het gebruik van dit model een combinatoir effect van twee soorten lever blessures bestudeerd. Om het diermodel van de ontwikkelde ALF te karakteriseren, zijn fysiologische en biochemische parameters bestudeerd. Succesvolle reversibiliteit van ALF werd bevestigd door transplantatie van syngene gezonde rat hepatocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hieronder beschreven procedure is goedgekeurd door het institutioneel Comité voor dierenethiek van het Nationaal Instituut voor immunologie, New Delhi. Het seriële referentienummer van de goedkeuring is IAEC # 355/14.
1. voorbereiding
- Bereid je voor op de chirurgische ingreep zoals eerder beschreven door Das B et al.26.
- Gebruik 6 – 8 weken oude inteelt Wistar ratten met een lichaamsgewicht van 200 – 250 g.
- Huisdieren onder de standaard dierenverzorgings condities en voer ze met Rat Chow en libitum voor en na de ingreep.
- Bij het uitvoeren van 70% PHx, gebruik maken van een standaard cocktail mix van ketamine hydrochloride (100 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht), die intraperitoneaal wordt geïnjecteerd.
Opmerking: het type anestheticum dat wordt gebruikt kan postoperatieve effecten hebben op de sterfte en morbiditeit. - Gebruik tijdens de celtransplantatie Inhalant anesthesie Isofluraan (2-chloor-2-(difluoromethoxy)-1, 1, 1-trifluoro-ethaan) om de tijd van het herstel van het dier na de transplantatie operatie te verminderen.
- Induceren en onderhouden van de inhalationele anesthesie met behulp van een aangepaste anesthesie systeem. Houd de zuurstoftoevoer op 4 L/min. Voor inductie gebruik Isofluraan bij 4% en voor onderhouds gebruik 2 – 3% tijdens de chirurgische ingreep.
2. preoperatieve procedures
- Anesthetiseer de rat door het injecteren van het mengsel ketamine-xylazine beschreven in stap 3,1 intraperitoneally. Bevestig de volledige anesthetisering door de teen van het dier te knijpen. Verdere procedures worden alleen uitgevoerd als er geen pedaal reflex is.
- Ter voorkoming van corneale uitdroging, breng een Carboxy methyl-cellulose-gebaseerde oogdruppel op beide ogen aan.
- Het verdoofd dier op een chirurgische bord met behulp van witte tape te rebelasten. Plaats het dier met de buikzijde naar boven gericht, zodat de mond aan de distale kant van de persoon die de operatie uitvoert.
- Verwijder het haar uit het bovenste rechter abdominale chirurgische gebied met behulp van een elektrische klipper.
- Desinfecteer de operatieplaats door drie alternerende Scrubs van Povidon jodium en 70% ethanol met behulp van gesteriliseerde katoenen pads in cirkelvormige beweging.
3. partiële hepatectomie (PHx) om 70% van de massa van de lever te verwijderen
Opmerking: Voer de volledige chirurgische ingreep uit onder een steriele omgeving in een laminaire stroom afzuigkap. Gebruik alleen steriele chirurgische instrumenten om het risico op infectie postoperatief te minimaliseren. Verwijdering van 70% van de lever massa, vernoemd 70% partiële hepatectomie (70% PHx), werd uitgevoerd zoals beschreven door C. Mitchell en H. Willenbring, 200827.
- Voorafgaand aan het begin van de operatie, bevestig de volledige anesthetisering van het dier door het knijpen van de teen. Verdere procedures worden alleen uitgevoerd als er geen pedaal reflex is.
- Markeer de te snijden huid net onder het borstbeen, loodrecht op de xiphoïde, en evenwijdig aan de ribcage.
- Plaats een steriel draperen blad met een opening van ongeveer 3 cm x 1 cm over de gemarkeerde huid.
- Voer een dwarse incisie van ongeveer 2 – 3 cm langs de gemarkeerde lijn met een scalpel. Gebruik chirurgische Blade No. 22. Verwijder voorzichtig de gehechtheid van de huid aan de onderliggende spierlaag in de nabijheid van het ingesneden gebied met behulp van steriele bevochtigde katoenen uiteinden.
- Maak vervolgens een dwarse incisie door de peritoneale laag net onder het xiphoïde proces.
- Met behulp van twee zoute bevochtigde katoenen tips, bloot de linker kwal van de lever door het toepassen van zachte druk op de thorax. Plaats een watten punt op het diafragmatische gebied van het ingesneden gedeelte en de andere katoenen punt onder het ingesneden gebied om de lever kwal omhoog te tillen.
- Schuif een 8 – 10 cm lange steriele nylon schroefdraad loop (maat 4 – 0, 0,15 mm diameter) rond de blootgestelde lever kwal. Neem de lus naar de basis van de kwab dicht bij de Hilum met behulp van microdissecting Tang of bevochtigde wattenstaafjes.
- Met de hulp van de microchirurgie naald houder en microforceps, binden de twee uiteinden van de lus, het plaatsen van de knoop zo dicht mogelijk bij de basis van de kwom het bloedvat te vernauwen en te verminderen bloeden nadat de lever kwal is verwijderd. BIND twee extra knopen aan de andere kant.
- Neem de voorzorg niet te binden de knoop te dicht bij de nabijgelegen bloedvaten, die anders kunnen leiden tot veneuze obstructie (stenose).
- Gebruik microchirurgie schaar te snijden de gebonden kwabben net boven de knoop, die laat een verkleurde massa van weefsel genaamd een ischemische stomp in plaats van de LOB.
Opmerking: de rat lever, net als die van muizen, is onderverdeeld in vier verschillende lobben: de mediane LOB, rechter laterale kwabben, linker laterale LOB, en caudatus Kwan, die ongeveer 40%, 20%, 30%, en 7% van de totale lever massa, respectievelijk vertegenwoordigen. Elke combinatie van deze lobben kan worden verwijderd om accijnzen 70% lever massa. In de huidige studie werden de mediane kwabben en linker laterale lobben verwijderd. - Zoek voorzichtig de mediaan kwab zonder beschadiging van de resterende stomp van linker laterale LOB. Trek het voorzichtig uit de buikholte, en aan de basis van de LOB binden een 8 – 10 cm lange nylon draad (grootte 4 – 0) knoop zoals eerder vermeld. BIND twee extra knopen aan de andere kant. Voorzichtig accijns en verwijder de gebonden mediaan kwab nemen van alle genoemde voorzorgsmaatregelen.
- Na het verwijderen van de lobben, hecht het peritoneum met behulp van een absorbeerbare chroom 4 – 0 hechtmiddel met continue steken gevolgd door huid met een onderbroken hechtdraad.
- Breng Povidon jodium op de huid rond de hechtingen om infectie te voorkomen.
- Verwijder het draperen blad en verwijder het dier uit het operatie bord.
4. postoperatieve verzorging bij dieren
- Intraperitoneaal Injecteer het dier met een dosis van 12 mg cefotaxime antibioticum in 1 mL 5% glucoseoplossing met een 1 mL spuit om het te beschermen tegen het risico van postoperatieve infectie.
- Dien een subcutane injectie van analgetisch Meloxicam (1 mg/kg lichaamsgewicht) toe voor pijnbestrijding na de operatie en volg het door twee andere doses, waarbij het regime als één dosis per dag wordt gehouden.
- Huis de bediende dieren onder standaardomstandigheden van 12 uur licht/donker cyclus en monitor op gezette tijden.
5. injectie van geneesmiddel in gedeeltelijk hepatectomized dieren om leverfalen te induceren
- Na 24 h na chirurgie, wanneer de dieren met succes zijn hersteld van 70% PHx, meet het lichaamsgewicht van het dier, gevolgd door de injecties.
- Injecteer 750 mg/kg lichaamsgewicht van APAP intraperitoneaal in gedeeltelijk hepatectomized dieren 24 h na de 70% PHx na het succesvolle herstel van de dieren door de chirurgische ingreep. Herhaal de dosis na 24 uur.
Opmerking: twee doses APAP worden intraperitoneaal toegediend aan het dier (d.w.z. 24 uur en 48 uur na respectievelijk de 70% PHx-procedure). - Meet op elk tijdstip na de injectie van APAP het lichaamsgewicht van het terugstellende dier.
Opmerking: APAP (biocetamol) wordt bij dieren geïnjecteerd als een oplossing van 150 mg/mL in 2% benzylalcohol.
6. transplantatie van gezonde hepatocyten in ALF diermodellen
Opmerking: voor het bestuderen van de reversibiliteit van ALF bij ratten, transplantatie gezonde syngene rat hepatocyten intrasplenisch in de ALF-geïnduceerde dieren samen met de 1St dosis van APAP. In de huidige studie, om voldoende tijd te bieden aan de getransplanteerde cellen voor homing en engraftment, de transplantatie werd gedaan net na het geven van de 1St dosis APAP. Rat hepatocyten worden geïsoleerd door een protocol voor het eerst gepubliceerd door Berry en Friends et al.28 en later aangepast in verschillende andere studies29,30,31 met enkele wijzigingen. Voor intrasplenic transplantatie van cellen in het ALF diermodel, volg de hieronder vermelde stappen.
- Plaats de rat in een poly (methylmethacrylaat) kamer voor inductie van anesthesie met 4% Isofluraan en 4 L/min zuurstoftoevoer voor een rat van 250 – 350 g lichaamsgewicht. Controleer op de diepte van de anesthesie door het ontbreken van pedaal reflexen bij het knijpen van de teen van het dier.
- Plaats de verdoofde rat op het chirurgische bord zodanig dat het linker laterale gedeelte naar boven is gericht. Onderhoud anesthesie bij 2 – 3% Isofluraan inademing via een geschikt mondstuk.
- Scheer de huid op de linker laterale regio en steriliseren door Povidon jodiumoplossing.
- Maak een dwarse incisie op het geschoren huidgebied.
- Maak een 1 – 2 cm cut in de peritoneale laag om de milt bloot.
- Verwijder voorzichtig de milt van de peritoneale Holte en til deze op met behulp van twee bevochtigde katoenen tips.
- Bewaar de cellen (meestal 107 per dier) die worden getransplanteerd in 50 ΜL imdm-media in een 1 ml insulinespuit met een naald van 29 G.
- Doorboren van de naald in de milt cortex en laat de celsuspensie in de milt binnen 2 – 3 min.
- Nadat de celtransplantatie is voltooid, verwijder voorzichtig de naald en DEP het gebied van de naald punctie met een bevochtigde katoenen tip om lekkage van de celsuspensie van de plaats te voorkomen.
- Sluit het peritoneum en de huid door een 4 – 0 absorbabele hechtdraad met continue en discontinue vernauwing respectievelijk.
- Breng Povidon jodiumoplossing op de huid op de plaats van de hechtingen om besmetting op de bediende plaats te voorkomen.
- Intraperitoneaal Injecteer 1 mL volume van 12 mg/mL antibioticum (bijv. cefotaxime) oplossing en Injecteer subcutaan analgetische (bijv. Meloxicam) 1 mg/kg lichaamsgewicht aan het dier als onderdeel van postoperatieve verzorging. Verplaats het dier naar een warm herstellende kooi.
- Houd het geopereerde dier geïsoleerd onder normale omstandigheden van 12 uur licht/donker cyclus totdat de chirurgische wonden volledig genezen zijn. Dit kan 3 – 4 dagen duren.
7. karakterisering van de ontwikkeling van ALF
- Euthanateren van de dieren door overdosering van ketamine-xylazine oplossing 2 h na de 2ND dosis APAP behandeling en het verzamelen van bloed en weefselmonsters.
- Verzamel serum uit bloed voor biochemische studies32.
- Verwerken van leverweefsel monsters voor histologische en genexpressie studies33,34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevingspercentage in diermodellen van ALF
De optimale dosis APAP om ALF te veroorzaken in combinatie met 70% PHx werd gestandaardiseerd als 750 mg/kg lichaamsgewicht. Het behandelingsregime startte 24 uur na 70% PHx, toen de dieren volledig waren hersteld van de operatie, en bestond uit twee APAP doses met een interval van 24 uur. De sterfte werd waargenomen bij een snelheid van 80% na de toediening van de tweede dosis APAP, 48 h na de operatie. Het overlevingspercentage werd geanalyseerd en uitgezet via de Kaplan-Meier-methode (Figuur 1). De reproduceerbaarheid in tijd van overlijden en tijdsperiode die wordt geboden door dit model maakt het een geschikte kandidaat voor het bestuderen van een therapeutische interventie tegen ALF.
Voor de studie werden vier groepen dieren overwogen: groep 1 (controlegroep, alleen zoutoplossing), groep 2 (alleen APAP bij 750 mg/kg lichaamsgewicht), groep 3 (zout behandeling met 70% PHx) en groep 4 (APAP bij 750 mg/kg lichaamsgewicht met 70% PHx). Drie dieren werden in alle groepen opgenomen en twee representatieve afbeeldingen zijn opgenomen in elke groep. Dieren van alle vier de groepen werden 2 uur na toediening van de 2ND dosis van de respectieve behandeling geëhaliseerd. Lever monsters genomen uit alle vier groepen toonde verschillende morfologie van elkaar. Groep 1 toonde de roodbruine morfologie van een gezonde knaagdier lever. Lever monsters van groep 2 vertoonden geen duidelijke tekenen van beschadiging op een morfologisch niveau en toonden een soortgelijk uiterlijk aan de gezonde levers van groep 1. Lever monsters genomen uit groepen 3 en 4 leek niet gezond en had verkleuring en een fragmentarisch uiterlijk. De verkleuring komt overeen met de beschadiging in het leverweefsel en was duidelijker zichtbaar in groep 4. Representatieve gegevens worden weergegeven in Figuur 2.
De mate van leverbeschadiging werd bepaald door het controleren van de serumspiegels van Alt, AST en Alp enzymen36,37,38. De niveaus van ALT, AST en ALP toonden duidelijke verschillen tussen de vier groepen die corresponderen met de omvang van leverschade. Groep 4 toonde een significante toename van de AST-en ALP-niveaus in vergelijking met groep 1 (Figuur 3).
Om het genexpressie profiel in controle en door Alf geïnduceerde groepen te vergelijken, werd q-PCR-analyse van genen die betrokken zijn bij celdood (Bax2, Caspase3, FAS) in leverweefsel monsters uitgevoerd35,39. Deze bleken te zijn upregulated in groep 3 in vergelijking met controlegroep 1, terwijl geen verschil werd waargenomen in groep 2 en groep 4. Genen waarvan bekend is dat ze worden uitgedrukt in reactie op leverbeschadiging (Mcp1 en Mmp2)33,40 bleken in alle drie de groepen upregulated te zijn in vergelijking met controlegroep 1. Mmp9 was upregulated in groepen 3 en 4, terwijl groep 2 geen duidelijk verschil toonde van controlegroep 1. De uitdrukkings niveaus van Timp1 en Timp234 bleken hoger te zijn in groep 3, maar vertoonden geen gemarkeerde overexpressie in groep 4 (Figuur 4).
Genen die betrokken zijn bij ontsteking van de lever (TNFA, IL1a, Tgfbr1 en IL1b)41,42,43,44 bleken te worden overuitgedrukt in groep 3 in vergelijking met controlegroep 1, maar hun uitdrukkings niveau werd verlaagd in groep 4. ALR wordt overuitgedrukt in leverweefsel na de inductie van leverbeschadiging. De stroomafwaartse cascades van dit gen helpen bij de lever regeneratie. RIP1 eiwit is noodzakelijk in APAP-geïnduceerde toxiciteit. ALR en RIP1 bleken in groepen 2 en 3 upregulated te zijn in vergelijking met controlegroep 1, terwijl hun niveaus in groep 4 vergelijkbaar of lager blijven. Alpha glad spier actine (aSMA), een marker van overmatige ECM depositie die verder leidt tot fibrose, bleek te zijn upregulated in groep 3 en 4 in vergelijking met controlegroep 1 (Figuur 4). Genexpressie gegevens suggereren dat de bovengenoemde biomarkers van ontsteking en celdood waarvan bekend is dat ze overexpressie zijn tijdens leverbeschadiging, upregulated zijn in leverweefsel monsters van dieren waarbij ALF werd geïnduceerd door de voorgestelde methode, waardoor het optreden van leverletsel op moleculair niveau werd bevestigd.
Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring
Hematoxylin en eosine (H & E) kleuring werd gedaan om de ernst van leverschade beoordelen door het observeren van de omvang van hepatocyte degeneratie. De leverweefsel secties gekleurd met H & E werden onderworpen aan blinde analyse door een derde partij. In de 70% partiële hepatectomie groep vesiculaire vetzuren degeneratie werd waargenomen en in de paracetamol groep periportal ontsteking en necrose werd gezien samen met milde sinusoïdale dilatatie. Vesiculaire vette degeneratie werd voornamelijk waargenomen in de ALF-groep (Figuur 5).
Protrombine tijd en bloedglucosespiegels
Protrombine tijd (PT) is een parameter die afhankelijk is van de activiteit van de lever-gesynthetiseerde weefsel tromboplastin en wordt gebruikt om de efficiëntie van het bloedstollings mechanisme te karakteriseren45. In het algemeen, een toename van PT wordt waargenomen in de omstandigheden van de lever-gerelateerde ziekten. PT bleek aanzienlijk hoger in de ALF-geïnduceerde groep in vergelijking met de controlegroep. De internationale genormaliseerde ratio (INR)45 bleek ook hoger te zijn, wat een defect in het bloedstollings mechanisme als gevolg van inefficiënte lever fysiologie vertegenwoordigt (Figuur 6).
Evaluatie van overleving na gezonde syngenische rat hepatocyten transplantatie
Een belangrijk criterium van een ALF-model is de reversibiliteit van leverfalen in de aanwezigheid van een therapeutische interventie. In de huidige studie werden 10.000.000 gezonde syngene rat hepatocyten getransplanteerd om het effect van celtransplantatie therapie op leverfalen te observeren. Het juiste aantal cellen dat moet worden getransplanteerd, werd bepaald door de reversibiliteit van leverfalen na transplantatie van verschillende celaantallen te observeren (gegevens niet weergegeven). Cellen werden getransplanteerd na toediening van de 1St dosis APAP, en overleving bleek te worden hersteld in dieren na de transplantatie van cellen (Figuur 7). De serumspiegels van enzymen ALT, AST en ALP bleken na 10 dagen celtransplantatie genormaliseerd te zijn (Figuur 8).
Figuur 1: overlevingspercentage in de door Alf geïnduceerde groep. Kaplan-Meier-overlevings curve die het overlevingspercentage van dieren weergeeft na inductie van ALF met de combinatie van 70% PHx en APAP dosis (750 mg/kg lichaamsgewicht). Tijd 0 h duidt de tijd aan van 70% PHx. De 1St en 2ND doses van APAP werden toegediend 24 en 48 h postoperatief (n = 12, totale dieren). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve beelden van lever morfologie in de vier verschillende groepen die in de studie zijn opgenomen. Beeld panelen A – D tonen de morfologie van de levers van verschillende groepen na zijn inslapen 2 h na de 2ND dosis van de respectieve behandeling. A) de lever morfologie van controlegroep 1, waarin alleen zoutoplossing is gegeven. B) de lever morfologie van groep 2 waarbij alleen APAP werd gegeven bij de dosis van 750 mg/kg lichaamsgewicht. C) de lever morfologie van groep 3 waarin zoutoplossing werd gegeven na 70% PHX.D) de lever morfologie in groep 4 waarin apap werd gegeven na 70% PHX bij de dosis die vergelijkbaar was met groep 3 (n = 3 dieren per groep). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: vergelijking van het biochemische Profiel van serum in de verschillende groepen. Staafdiagrammen vertegenwoordigen de gemiddelde waarde van ALT, AST en ALP in serummonsters van de vier groepen die in het onderzoek zijn opgenomen. Serum werd verzameld 2 h na de 2ND dosis van de respectieve behandeling. Foutbalken = S. E. M; = p < 0,001; * = p < 0,05; n = 3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: genexpressie profiel van leverweefsel monsters. Staafdiagrammen vertegenwoordigen de relatieve kwantificering van de mRNA-uitdrukking van verschillende genen die betrokken zijn bij ontsteking en celdood in de vier groepen die onderworpen zijn aan verschillende behandelingen. Alle genen werden genormaliseerd tegen de uitdrukking van controle Gapdh. Foutbalk = standaardfout gemiddelde van de drie verschillende monsters (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: histologische studie van leverweefsel monsters. Representatieve hematoxyline en eosine kleuring beelden van leverweefsel monsters uit de vier groepen opgenomen in de studie, zoals waargenomen onder 200x vergroting in heldere veld microscopie. Er waren meestal normale hepatocyten in controlegroep 1 met milde periportal infiltratie (groene pijlen). In groep 3 (70% partiële hepatectomie) vesiculaire vetzuren degeneratie werd waargenomen (witte pijlen) en in de paracetamol groep 2 periportal ontsteking (rode pijlen) en necrose werden gezien samen met milde sinusoïdale dilatatie (gele pijlen). Macrovesiculaire vervetting werd meestal waargenomen in de ALF groep 4 (oranje pijlen). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: vergelijking van protrombine tijd (PT) en internationale genormaliseerde ratio (INR). A) vergelijking van de PT tussen controlegroep 1 (zout injectie post 70% PHX) en Alf-geïnduceerde groep 4 (APAP-injectie post 70% PHX). Bloed werd verzameld 2 h na de 2ND dosis van de respectieve behandeling en tijd (in seconden) nodig voor de vorming van fibrine stolsel wordt weergegeven op de Y-as (* * * * = p < 0,0001, n = 5). B) de INR in de door Alf geïnduceerde groep 4 in vergelijking met controlegroep 1. De gemiddelde waarde van INR in groep 4 bleek 2,28 te zijn, die valt in het door warfarine geïnduceerde anti-coagulerend effect (n = 5). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: overlevingspercentage in Alf-geïnduceerde groep na celtransplantatie. Kaplan-Meier-overlevings curve die het overlevingspercentage weergeeft na een gezonde hepatocyten transplantatie in de door ALF geïnduceerde groep 4 in vergelijking met controlegroep 1 (n = 5). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: serum biochemisch Profiel van Alf-geïnduceerde dieren na celtransplantatie. Serumspiegels van enzymen ALAT, ASAT en ALP 10 dagen na transplantatie van cellen in vergelijking met de serumspiegels van ALF-geïnduceerde dieren die na een dosis van 2ND van de APAP-toediening werden geëeseerd. Foutbalk = standaardfout van het gemiddelde van vijf verschillende monsters; = p < 0,0001; * * = p > 0,01; n = 5. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van een geschikt diermodel voor ALF is van het allergrootste belang voor een beter begrip van pathogenese en progressie van ALF. Een goed gekarakteriseerd ALF diermodel biedt ook de mogelijkheid voor de ontwikkeling en beproeving van nieuwe therapeutische benaderingen tegen ALF. Er zijn veel pogingen gedaan om een klinisch relevant model van Alf6,12,21,23,46,47,48te ontwikkelen. De meeste van deze studies maken gebruik van chirurgische procedures of induceren leverschade door Hepatotoxische chemicaliën.
Het is moeilijk om een ALF-model door PHx alleen te maken omdat PHx de pathologie van ALF niet zou weerspiegelen vanwege de afwezigheid van ontsteking veroorzaakt door de necrotische en apoptotische weefsels. Bij therapeutische doses, APAP wordt volledig gemetaboliseerd door de processen van glucoronidatie en sulfamatie. Bij hogere doseringen, wanneer deze trajecten zijn verzadigd, APAP wordt gemetaboliseerd door cytochroom P450 enzymen die voornamelijk worden gesynthetiseerd door hepatocyten, resulterend in de vorming van een toxisch intermediair, NAPQI (N-acetyl-p-Benzochinon imine). Onder normale omstandigheden wordt napqi geneutraliseerd door de glutathion (GSH) reserves van cellen, terwijl bij supratherapeutische doses het veroorzaakt oxidatieve stress in hepatocyten, resulterend in hepatocyte overlijden4,24,25,46. Vandaar, door het combineren van de fysiologische effecten van 70% PHx en APAP-geïnduceerde leverschade, een ALF rat model werd gemaakt in de huidige studie. Een kleiner therapeutisch venster vermindert de stress periode op het dier. In combinatie met kleinere doses APAP leidt dit tot een betere reproduceerbaarheid van de procedure.
De dosis APAP werd geselecteerd om een geschikt therapeutisch venster te bieden gedurende welke een therapeutische interventie aan het dier kan worden gegeven (d.w.z. binnen 48 h van de dosis 1St en 24 uur van 2ND dosis). Binnen 24 uur na de 2ND dosis apap werd 100% sterfte waargenomen. De tijd van overlijden binnen deze periode was echter variabel voor elk dier. Vandaar dat voor het bestuderen van de ontwikkeling van ALF, de dieren op een standaardtijd punt van 2 uur na de 2ND dosis APAP werden geëhaliseerd.
De tijd van therapeutische interventie kan worden bepaald afhankelijk van de individuele studie en het type therapie dat wordt bestudeerd, die in de huidige studie was transplantatie van syngene rat hepatocyten net na de 1St dosis APAP, waardoor de cellen genoeg tijd om thuis en graveren. In het huidige model is transplantatie van ten minste 10.000.000 cellen vereist voor een succesvolle redding van ALF.
Om het succes van de chirurgische ingreep te garanderen, moeten enkele belangrijke punten in overweging worden genomen. Het wordt aanbevolen om verschillende soorten anesthetica te gebruiken in verschillende chirurgische ingrepen. Om gedeeltelijke hepatectomie uit te voeren, moet een cocktail van ketamine-xylazine worden gebruikt in de aanbevolen doseringen, omdat het voldoende tijd geeft om de chirurgische ingreep te voltooien. Tijdens de celtransplantatie, inhaleerbaar anesthesie Isofluraan moet worden gebruikt omdat het vermindert de fysieke stress op Alf-geïnduceerde dieren.
Concluderend, als gevolg van een uniforme sterftecijfer en een handige therapeutische venster, een APAP en 70% PHx gecombineerd model werd gebruikt om te bestuderen van de reversibiliteit van ALF door celtransplantatie. Om de reversibiliteit van ALF te beoordelen, werden 10.000.000 gezonde syngene rat hepatocyten geïntransplanteerd in de door ALF geïnduceerde dieren. Na transplantatie bleek het overlevingspercentage verhoogd te zijn in door ALF geïnduceerde dieren. Verbetering van de serumspiegels van ALT, AST en ALP werd ook waargenomen bij dieren na celtransplantatie, wat suggereert dat het metabolisme van de lever werd hersteld. Deze ALF diermodel presenteert een alternatief voor het evalueren van het therapeutische potentieel van cellen overbruggen van de kloof tussen acute leverfalen en levertransplantatie. Het biedt ook de mogelijkheid om te bestuderen van leverschade veroorzaakt door lichamelijk letsel en Hepatotoxische agent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de kern subsidie van het departement biotechnologie, de regering van India, aan het Nationaal Instituut voor immunologie, New Delhi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, Suppl 2 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
