قياس نشاط الكيتيناز في العينات البيولوجية
Summary
المعروضة هنا هي طريقة بسيطة لقياس نشاط الكيتيناز في السوائل البيولوجية مثل غسل القصبات الهوائية أو المصل.
Abstract
الكيتيناسيس هي الإنزيمات التي تلتشق الكيتين. حتى في غياب الكيتين، الثدييات لديها كميات كبيرة من الكيتيناالموجودة في الجسم بما في ذلك في خط الأساس. لا يعرف الدور الدقيق للكيتيناز، ولكن كان يعتقد أن تلعب دورا هاما في الهضم والدفاع المضيف ضد المواد الغذائية التي تحتوي على الكيتين ومسببات الأمراض، على التوالي. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة، بما في ذلك عملنا، دورا هاما من البروتينات مثل الكيتيناز والكيتينا في الحصانة المضيفة وأمراض الحساسية. الأهم من ذلك، أنشطة الكيتيناز بمثابة علامات حيوية هامة لشدة المرض في مجموعة واسعة من الأمراض بما في ذلك الأمراض الالتهابية من النوع 2 مثل الربو والتليف الرئوي. وبالمثل، فإن المرضى الذين يعانون من اضطرابات وراثية مثل مرض Gaucher قد ارتفعت بشكل ملحوظ مستويات الكيتيناز، والتي لا ترتبط فقط مع شدة المرض ولكن أيضا بمثابة علامة حيوية موثوق بها للفعالية العلاجية. يصف البروتوكول الموضح هنا طريقة بسيطة وسريعة ومباشرة لقياس نشاط الكيتيناز في BAL أو عينات المصل من الفئران ويمكن تكييفها على نطاق واسع مع البشر والكائنات الحية النموذجية الأخرى بسبب الطبيعة المحفوظة للغاية للإنزيمات.
Introduction
الكيتين هو ثاني أكثر السكاريد وفرة على الأرض بعد السليلوز، وهو بمثابة مكون هيكلي رئيسي لمجموعة متنوعة من الكائنات الحية بما في ذلك الهيكل الخارجي للحشرات والفطريات والخميرة والطحالب. بعض الفقاريات لديها أيضا الكيتين1. الكيتيناسيس هي عائلة من الإنزيمات التي هي قادرة على كسر الكيتين ويتم حفظها بشكل كبير في جميع أنحاء التطور في الأنواع التي تتراوح بين البكتيريا والثدييات2،3. بالإضافة إلى الكيتيناسيس ، الثدييات لديها أيضا البروتينات الشبيهة الكيتينازي التي تشبه الكيتيناسيس في قدرتها على ربط الكيتين ولكنها تختلف من حيث أنها تفتقر إلى القدرة الأنزيمية على شق الكيتين4.
على الرغم من أن الكيتين والكيتيناقد قد تمت دراستهما منذ فترة طويلة – مع التحقيقات التي يعود تاريخها إلى أوائل عام 1900 – كان التركيز الرئيسي على دورها في الحشرات واللافقاريات الأخرى. في الواقع، لم يكن حتى 1960s عندما تم العثور على الفقاريات أن يكون الكيتينا على الإطلاق. باستخدام إجراء بفحص قائم على الشيتوية، تبين أن الكيتيناس موجود في الجهاز الهضمي لعدد من الفقاريات بما في ذلك السحالي والطيور السوداء – وهي ملاحظة يفترض أنها ترجع إلى استهلاك الكائنات التي تحتوي على الكيتين مثل الحشرات5 .
الثدييات لها شكلان نشطان من الكيتيناز الأنزيمية: الكيتيناز الثدييات الحمضية (AMCase؛ المعروف أيضا باسم CHIT2 وCHIA) وchitotriosidase (CHIT1)4. كل من هذه البروتينات قادرة على تحلل الكيتين. ومع ذلك، CHIT1 هو أكثر نشاطا الأنزيمية في البشر، حيث تقريبا كل من نشاط الكيتيناز مشتق من CHIT1. 4 في الفئران، كل من Chit1 وAMCase تسهم على قدم المساواة تقريبا في النشاط الكيتينازي العام6. من ناحية أخرى، البروتينات الشبيهة الكيتيناز تفتقر إلى نشاط الكيتيناز.
تفرز Chit1 أساسا من قبل الضامة وغالبا ما تعتبر استجابة مناعية لمسببات الأمراض التي تحتوي على الكيتين7. وقد ثبت أيضا أن الإنزيم تشارك في نضج الخلايا الأحادية في كل من M1 و M2 الأنواع الفرعية الضامة، حتى من دون وجود الكيتين الركيزة8. وعلاوة على ذلك، فإنه قد تشارك أيضا في نضج الخلايا المناعية الأخرى بما في ذلك T مساعد نوع 2 (Th2) الخلايا والحمضات – كما تبين أن يكون الحال في عدوى الرئة cryptococcal9. وتشير هذه الدراسات إلى دور معقد من الكيتيناسيس في الجهاز المناعي.
في السنوات الأخيرة، تم العثور على مستويات Chit1 لتكون بمثابة علامة حيوية هامة للتقدم لأكثر من 40 أمراض بشرية مختلفة بما في ذلك أمراض التخزين الليسوسومية، والأمراض المعدية، وأمراض الجهاز التنفسي، وأمراض الغدد الصماء، والقلب والأوعية الدموية الأمراض، والأمراض العصبية، وغيرها (استعرض10). في العديد من هذه الأمراض، ومستويات Chit1 هي توقع قوي لشدة المرض والفعالية العلاجية10.
كما اكتسبت الكيتينا سمعة كعلامة حيوية للعديد من الحالات الطبية بما في ذلك مرض Gaucher، وقد وضعت أدوات واختبارات لتسهيل اختبار وجود الكيتيناز. وتشمل الأساليب القديمة إجراء Schales، بروتوكول تكييفها من اختبار الجلوكوز في الدم، وطريقة حمض الدينتيروساليك 3،5 (DNS). ومع ذلك، فإن هذه الأساليب غالبا ما تكون حساسة للوقت وصعبة من الناحية التقنية11. يتطلب الإجراء لكلا الاختبارين الحد من المواد المؤكسدة غير العضوية، الفيريسيد في حالة إجراء Schales على سبيل المثال، مما يؤدي إلى تغيير اللون الذي لا يمكن قياسه إلا من حيث الطيف. بالإضافة إلى ذلك، كلا الاختبارين ينطوي على التدفئة أو خطوة الغليان التي تستغرق وقتا طويلا وضرورية للون لتطوير12،13.
وصف هنا هو اختبار الفلورة سريعة وبسيطة لتحديد مستويات الكيتينازي في عينات الثدييات14،15. اثنين من العينات المستخدمة هنا تشمل المصل وسوائل غسل القصبات الهوائية (BAL)؛ كما تم قياس نشاط الكيتيناز في عينات حليب الثدي والبول، ويمكن إجراء هذه التقنية في هذا النوع من العينات وكذلك في أي سائل بيولوجي آخر16،17.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد برز نشاط الكيتينازي كعلامة حيوية هامة للتنبؤ بخطورة المرض، وتطور المرض، والفعالية العلاجية ووجود مسببات أمراض محددة18. على الرغم من أن العديد من النظريات المفترضة منذ فترة طويلة حول دور الكيتينالم لم يتم إثباتها تجريبيا19، قدمت دراسات جديدة رؤى هامة في دور ال…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من قبل جمعية الرئة الأمريكية والجمعية الأمريكية للصدر جوائز LS. الكتاب يريدون بصدق أن أشكر الدكتور جاك إلياس والدكتور تشون جون لي لتوفير سلالات الماوس المعدلة وراثيا.
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
Referências
- Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
- Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).
- Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, 1-9 (2012).
- Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
- Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).
- Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).
- Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
- Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).
- Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).
- Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
- Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).
- Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).
- Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).
- Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).
- Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).
- Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).
- Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
- Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).
- Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).
- Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).
- Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).
- Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).
- Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
- Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).
- Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).
- Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
