Измерение активности читиназа в биологических образцах
Summary
Здесь представлен простой метод измерения активности хитиназы в биологических жидкостях, таких как бронхоальвеолярная лаваж или сыворотка.
Abstract
Читиназа являются ферментами, которые расщепляют хитин. Даже при отсутствии хитина млекопитающие имеют значительное количество хитиназах, присутствующих в организме, в том числе на исходном уровне. Точная роль хитиназа не известна, однако считалось, что она играет важную роль в пищеварении и защите организма от содержания хитина и патогенов, соответственно. Последние работы, в том числе наша, показали важную роль хитиназа и хитиназа, как белки в иммунитет хозяина и аллергических заболеваний. Важно отметить, что хитиназа деятельности служат важными биомаркерами тяжести заболевания в широком диапазоне заболеваний, включая тип 2 воспалительных заболеваний, таких как астма и легочный фиброз. Аналогичным образом, пациенты с генетическими расстройствами, как болезнь Гоше имеют значительно повышенный уровень хитиназа, которые не только коррелируют с тяжестью заболевания, но и служат надежным биомаркером для терапевтической эффективности. В описанном здесь протоколе описывается простой, быстрый и простой способ измерения активности хитиназы в образцах БАТ или сыворотки мышей и может быть широко адаптирован к человеческим субъектам и другим типообразуя организмам из-за высокосохранительной природы ферментов.
Introduction
Читин является вторым наиболее распространенным полисахаридом на земле после целлюлозы, выступающей в качестве основного структурного компонента различных организмов, включая экзоскелет насекомых, грибов, дрожжей и водорослей; некоторые позвоночные также имеют хитин1. Читиназы представляют собой семейство ферментов, которые способны разрушать хитин и высоко сохраняются на протяжении всей эволюции в видах, начиная от бактерий до млекопитающих2,3. В дополнение к хитиназы, млекопитающие также имеют хитиназы, как белки, которые похожи на хитиназы в их способности связывать хитин, но отличаются тем, что они не имеют ферментатической способности расщеплять хитин4.
Хотя хитин и хитиназы уже давно изучены, исследования датируются началом 1900-х годов, основное внимание уделяется их роли в насекомых и других беспозвоночных. В самом деле, он не был до 1960-х годов, когда позвоночные были найдены, что хитиназа на всех. Использование цитобиазного анализ, хитиназы были показаны, чтобы быть найдены в пищеварительном тракте ряда позвоночных, включая ящериц и черных дроздов-наблюдение предположил, что из-за потребления хитина содержащих организмов, таких как насекомые5 .
Млекопитающие имеют две ферментативно активные формы хитиназы: кислую хитиназу млекопитающих (AMCase; также известный как CHIT2 и CHIA) и chitotriosidase (CHIT1)4. Оба этих белка способны гидролизовать хитин. Тем не менее, CHIT1 более ферментативно активен у людей, где почти вся активность хитиназы происходит от CHIT1. 4 У мышей, как Chit1 и AMCase почти в равной степени способствовать общей активности хитиназы6. С другой стороны, хитиназоподобные белки не имеют хитиназной активности.
Chit1 в основном выделяется макрофагами и часто считается иммунным ответом на хитинсодержащие патогены7. Фермент также было показано, что участвует в созревании моноцитов в обоих M1 и M2 макрофаг подтипов, даже без присутствия субстрата хитина8. Кроме того, он также может быть вовлечен в созревание других иммунных клеток, включая T помощник типа 2 (Th2) клетки и эозинофилы, как было показано в случае криптококковой инфекции легких9. Эти исследования указывают на сложную роль хитиназав в иммунной системе.
В последние годы, Chit1 уровни были найдены в качестве важного биомаркера прогрессирования для более чем 40 различных заболеваний человека, включая лисосомальные заболевания хранения, инфекционные заболевания, респираторные заболевания, эндокринологические заболевания, сердечно-сосудистые заболеваний, неврологических заболеваний и др. (обзор10). Во многих из этих заболеваний, уровни Chit1 являются сильным предиктором тяжести заболевания и терапевтической эффективности10.
Как хитиназа приобрели репутацию биомаркера для многочисленных заболеваний, включая болезнь Гоше, инструменты и анализы были разработаны для облегчения тестирования на наличие хитиназа. Более старые методы включают процедуру Schales, протокол приспособленный от испытания глюкозы крови, и метод 3.5 динитрозалиловной кислоты (DNS). Тем не менее, эти методы часто чувствительны к времени и технически трудно11. Процедура для обоих из этих испытаний требует уменьшения неорганических окислителей, ferricyanide в случае процедуры Schales например, производя изменение цвета которое можно только измерить спектрофотометрическо. Кроме того, оба теста включают нагревание или кипячение шаг, который является одновременно трудоемким и необходимым для цвета развиваться12,13.
Описано здесь быстрый и простой фторметрический анализ для определения уровня хитиназы в образцах млекопитающих14,15. Два из используемых здесь образцов включают сыворотку и бронхоальвеолярные лавовые жидкости (BAL); хитиназа активность также измеряется в грудном молоке и моче образцов, и техника может быть выполнена в этих типах образцов, а также в любой другой биологической жидкости16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Активность читиназа стала важным биомаркером для прогнозирования тяжести заболевания, прогрессирования заболевания, терапевтической эффективности и наличия специфических патогенов18. Хотя многие из давно постулируемых теорий о роли хитиназ не были экспериментально док…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Американской ассоциацией легких и Американского торакального общества награды LS. Авторы искренне хотят поблагодарить доктора Джека Элиаса и доктора Чун Кын Ли за предоставление трансгенных штаммов мыши.
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
Referências
- Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
- Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).
- Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, 1-9 (2012).
- Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
- Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).
- Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).
- Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
- Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).
- Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).
- Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
- Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).
- Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).
- Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).
- Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).
- Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).
- Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).
- Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
- Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).
- Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).
- Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).
- Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).
- Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).
- Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
- Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).
- Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).
- Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
