Un modelo de cultivo de órgano endotelial Corneal porcino usando botones de córnea divididos

Summary

Aquí, se presenta un protocolo paso a paso para la preparación y el cultivo de botones corneales divididos porcinos. Como este modelo de cultivo de órganos típicamente cultivado organomuestra tasas de mortalidad celular en un plazo de 15 días, comparables a las córneas de donantes humanos, representa el primer modelo que permite el cultivo a largo plazo de córneas no humanas sin añadir dextran tóxico.

Abstract

La investigación experimental en células endoteliales corneales se asocia con varias dificultades. Las córneas de donantes humanos son escasas y rara vez están disponibles para investigaciones experimentales, ya que normalmente se necesitan para el trasplante. Los cultivos celulares endoteliales a menudo no se traducen bien a situaciones in vivo. Debido a las características bioestructurales de las córneas no humanas, la hinchazón estromal durante el cultivo induce una pérdida sustancial de células endoteliales corneales, lo que dificulta la realización del cultivo durante un largo período de tiempo. Los agentes de hinchazón, como el deextran, se utilizan para contrarrestar esta respuesta. Sin embargo, también causan pérdida significativa de células endoteliales. Por lo tanto, se estableció un modelo de cultivo de órganoex vivo que no requería agentes de salzados. Los ojos de cerdo de un matadero local se utilizaron para preparar botones de córnea divididos. Después de la trephinación corneal parcial, se eliminaron las capas externas de la córnea (epitelio, capa de arco, partes del estroma). Esto reduce significativamente la pérdida de células endoteliales corneales inducida por la hinchazón estromal masiva y el plegado de membrana de Descemet durante períodos de cultivo más largos y mejora la preservación general de la capa celular endotelial. La posterior trephinación corneal completa fue seguida por la eliminación del botón corneal dividido del bulbo ocular restante y el cultivo. La densidad de las células endoteliales se evaluó en momentos de seguimiento de hasta 15 días después de la preparación (es decir, los días 1, 8, 15) utilizando microscopía ligera. La técnica de preparación utilizada permite una mejor preservación de la capa celular endotelial habilitada por una menor hinchazón del tejido estromal, lo que resulta en tasas de disminución lentas y lineales en los botones de la córnea dividida comparables a las córneas de donantes humanos. Como este modelo de investigación organo-típicamente cultivado estandarizado por primera vez permite un cultivo estable durante al menos dos semanas, es una alternativa valiosa a las córneas de donantes humanos para futuras investigaciones de diversos factores externos con respecto a sus efectos sobre el endotelio corneal.

Introduction

Los procedimientos de trasplante de córnea se encuentran entre los trasplantes más comúnmente realizados en todo el mundo¹. Como hay una grave escasez de córneas de donantes humanos, la investigación experimental que aborda las células endoteliales corneales en las córneas humanas es difícil de realizar¹. Sin embargo, la introducción de soluciones de riego y otras sustancias utilizadas en el ojo, dispositivos viscoelásticos oftálmicos, así como instrumentos y técnicas quirúrgicas (por ejemplo, instrumentos y técnicas de facoemulsificación, energía de ultrasonido) requiere investigaciones válidas y extensas sobre sus efectos en el endotelio corneal antes del uso clínico.

Existen pocas alternativas a las córneas de donantes humanos para la investigación. Los modelos de investigación animal son muy valiosos, pero al mismo tiempo muy consumidos en los recursos y cada vez más cuestionados éticamente. Un inconveniente importante de los cultivos celulares in vitro es su traducción limitada al ojo humano. Los resultados obtenidos de los cultivos celulares pueden ser incongruentes a condiciones in vivo, porque las células pueden someterse a una transición mesenquimal endotelial (EMT), lo que resulta en morfología similar a un fibroblasto causado por la pérdida de polaridad celular y cambios en la forma celular y el gen expresión².

Mientras que los modelos ex vivo anteriores reportaron períodos de cultivo de hasta 120 h,^{recientemente} se ^{introdujo una novedosa técnica de preparación para establecer un modelo de cultivo de órganos endoteliales corneales porcinos mediante el cultivo de córneas frescas de cerdo durante al menos 15 días ,4,5,6}. Si el epitelio corneal y partes del estroma se retiran (aproximadamente 300 m en total) de la córnea antes del cultivo, la hinchazón del estroma se reduce en botones corneales divididos, lo que resulta en una menor pérdida de células endoteliales y una capa celular después de hasta 15 días, mientras que los botones corneales no divididos muestran una pérdida significativa de células endoteliales debido a la hinchazón estromal desigual y la formación de los pliegues de Descemet. Los bancos oculares generalmente usan agentes deshinchados osmóticos como la despolvación para reducir la hinchazón de las córneas antes del trasplante. Sin embargo, se demostró que estos agentes inducen un aumento de la pérdida de células endoteliales^7,8,9.

Este artículo tiene como objetivo visualizar este modelo de investigación ex vivo estandarizado en un protocolo detallado paso a paso con el fin de permitir a los futuros investigadores realizar investigaciones sobre el endotelio corneal utilizando botones de córnea divididos. Este modelo representa un método sencillo para probar sustancias y técnicas utilizadas dentro del ojo, como dispositivos viscoelásticos oftálmicos, soluciones de riego y energía de ultrasonido, u otros procedimientos donde el endotelio corneal es de interés.

Protocol

Este protocolo sigue las pautas éticas de nuestra institución. De acuerdo con los estatutos del comité de revisión ética de nuestra institución no se tuvo que obtener ninguna aprobación ética antes de los experimentos, ya que todas las córneas porcinas se obtuvieron del matadero local. 1. Cultivo de órganos Prepara los ojos de cerdo. Del matadero local, obtener ojos de cerdo que fueron retirados poco después de la autopsia, pero antes del tratamiento térmico. Tran…

Representative Results

La técnica de disección presentada implica la eliminación parcial del tejido estromal, lo que resulta en una muestra de córnea más delgada y, por lo tanto, menos hinchazón estromal(Figura 1 y Figura 2). Menos hinchazón estromas induce menos fuerzas de cizallamiento y pellizcar que tienen un impacto negativo en el endotelio corneal, causando así menores tasas de pérdida de células endoteliales6. L…

Discussion

Este protocolo proporciona un método para la preparación de botones corneales divididos porcinos, que representa un modelo de cultivo de órgano sendotial endotelial endotelial ex vivo estandarizado y de bajo costo para fines de investigación^6. Los botones corneales divididos porcinos mostraron una disminución de la densidad celular endotelial comparable a las pérdidas de células endoteliales observadas en córneas de donantes humanos cultivadas en bancos oculares durante un período de dos …

Materials

Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland