Imágenes nanoscópicas de secciones de tejido humano a través de la expansión física e isotrópica
Summary
Las imágenes a nanoescala de muestras de tejido clínico pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. La patología de expansión (ExPath) es una versión de la microscopía de expansión (ExM), modificada por compatibilidad con muestras de tejido sortea estándar, para explorar la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios limitados de difracción convencional.
Abstract
En la patología moderna, la microscopía óptica desempeña un papel importante en el diagnóstico de enfermedades al revelar estructuras microscópicas de muestras clínicas. Sin embargo, el límite fundamental de difracción física impide el interrogatorio de la anatomía a nanoescala y los cambios patológicos sutiles cuando se utilizan enfoques de imágenes ópticas convencionales. Aquí, describimos un protocolo simple y barato, llamado patología de expansión (ExPath), para imágenes ópticas a nanoescala de tipos comunes de muestras de tejido primario clínico, incluyendo tejido de parafina incrustada fija o fija de formalina (FFPE) Secciones. Este método elude el límite de difracción óptica transformando químicamente las muestras de tejido en híbridos de tejido-hidrogel y expandiéndolas físicamente isotrópicamente a través de múltiples escalas en agua pura. Debido a la expansión, las moléculas previamente irresueltas se separan y por lo tanto se pueden observar utilizando un microscopio óptico convencional.
Introduction
Investigar la organización molecular de los tejidos en un contexto tridimensional (3D) puede proporcionar una nueva comprensión de las funciones biológicas y el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, estos entornos a nanoescala están más allá de las capacidades de resolución de los microscopios limitados de difracción convencionales (200-300 nm), donde la distancia mínima resuelta, d se define por d <!–
–> a/NA. Aquí está la longitud de onda de la luz y NA es la apertura numérica (NA) del sistema de imágenes. Recientemente, la visualización directa de moléculas etiquetadas fluorescentes ha sido posible gracias a las técnicas de imagen de superresolución recientemente desarrolladas1,2,3, incluyendo el agotamiento de emisiones estimulada (STED), microscopía de localización fotoactivada (PALM), microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y microscopía de iluminación estructurada (SIM). Aunque estas técnicas de imagen han revolucionado la comprensión de la función biológica a escala nanométrica, en la práctica, a menudo se basan en equipos costosos y/o especializados y pasos de procesamiento de imágenes, pueden tener un tiempo de adquisición más lento en comparación con imágenes ópticas convencionales, requieren fluoróforos con características específicas (como la capacidad de fotoconmutación y/o alta fotoestabilidad). Además, sigue siendo un desafío realizar imágenes de superresolución 3D en muestras de tejido.
La microscopía de expansión (ExM), introducida por primera vez en 20154, proporciona un medio alternativo de imagen de características a nanoescala (<70 nm) mediante la expansión física de muestras conservadas incrustadas en un hidrogel de polielectrolito hinchable. Aquí, las biomoléculas clave y/o las etiquetas están ancladas in situ a una red de polímeros que se puede expandir isotópicamente después del procesamiento químico. Debido a que la expansión física aumenta la resolución efectiva total, las moléculas de interés se pueden resolver utilizando sistemas de imágenes convencionales con limitación de difracción. Desde la publicación del protocolo original, donde las etiquetas fluorescentes sintetizadas a medida estaban ancladas a la red de polímeros4, se han utilizado nuevas estrategias para anclar directamente proteínas (retención de proteínas ExM, o proExM)5, 6,7,8,9 y ARN9,10,11,12 al hidrogel, y aumentar el aumento físico a través de la iteración expansión13 o adaptación de la química de gel8,14,15.
Aquí presentamos una versión adaptada de proExM, llamada patología de expansión (ExPath)16,que ha sido optimizada para formatos de patología clínica. El protocolo convierte muestras clínicas, incluyendo parafina incrustada en parafina fija de formalina (FFPE), teñidas de hematoxilina y eosina (H&E), y muestras de tejido humano recién congeladas montadas en diapositivas de vidrio, en un estado compatible con ExM. Las proteínas se anclan al hidrogel y se realiza la homogeneización mecánica (Figura 1)16. Con una expansión lineal de 4 veces de las muestras, las imágenes multicolores de superresolución (70 nm) se pueden obtener utilizando un microscopio confocal convencional con una resolución de sólo 300 nm y también se pueden combinar con otras técnicas de imagen de superresolución.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos el protocolo ExPath16,una variante de proExM5 que se puede aplicar a los tipos más comunes de muestras de biopsia clínica utilizadas en patología, incluyendo FFPE, H&E y muestras congeladas frescas en diapositivas de vidrio. La conversión de formatos, la recuperación de antígenos y la inmunomanchación de las muestras siguen protocolos comúnmente utilizados que no son específicos de ExPath. A diferencia del protocolo proExM original<sup class="xre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el fondo de start-up de la Facultad de la Universidad Carnegie Mellon (YZ) y el Nuevo Premio Innovador del Director de NIH (DP2 OD025926-01 a YZ).
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
Referências
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