本报告描述了一种基于微流体芯片的方法,用于建立单细胞培养实验,实现多个单细胞的高效配对和微观分析。
细胞共培养测定已广泛用于研究不同细胞类型之间的细胞-细胞相互作用,以更好地了解包括癌症在内的疾病的生物学。然而,使用传统的共生系统来澄清高异质细胞群中细胞间相互作用的复杂机制具有挑战性,因为细胞亚群的异质性被平均值所掩盖;传统的共培养系统只能用于描述总体信号,但不能跟踪单个细胞的行为。此外,传统的单细胞实验方法由于泊森分布而降低细胞操作效率。微制造器件是单细胞研究的新兴技术,因为它们能以高通量精确操作单个细胞,并能减少样品和试剂的消耗。在这里,我们描述了微流体芯片在多种单细胞共培养物中的概念和应用。该芯片可以有效地捕获培养室中的多种类型的单个细胞(+46%)并有足够的培养空间可用于研究细胞在单细胞级细胞-细胞相互作用下的行为(如迁移、增殖等)。淋巴内皮细胞和口腔鳞状细胞癌用于在微流体平台上进行单细胞共培养实验,进行活多细胞相互作用研究。
高效捕获不同类型的单细胞,并提供足够的培养空间,为多种类型的单细胞的单个细胞共培养实验1。限制稀释是准备单细胞用于此类实验的最常见方法,因为所需的设备成本低。然而,由于泊森分布的限制,最大单细胞采集概率仅为37%,使得实验操作费力大,耗时2.相比之下,使用荧光活化细胞分拣(FACS)可以克服泊森分布限制,以高效制备单细胞3。然而,由于仪器仪表和维护费用高昂,一些实验室可能无法进入外地资产管制系统。微造设备最近被开发用于单细胞陷印4,单细胞配对5和单细胞培养应用。这些设备基于其准确操作单细胞6、执行高通量实验或减少样品和试剂消耗的能力而具有优势。然而,使用当前微流体装置对多种细胞类型进行单细胞共培养实验仍然具有挑战性,因为泊森分布1、7、8或不能设备捕获两种以上类型的单个细胞4,5,6,9,10。
例如,Yoon等人报告了用于细胞-细胞相互作用研究的微流体装置11。此设备使用概率方法在一个腔室中配对细胞。但是,由于设备结构的几何限制,它只能实现两种不同单元类型的配对。另一份来自Lee等人的报告展示了一种确定性的方法来捕获和配对单个细胞12。此设备通过确定性方法提高了配对效率,但受配对单元所需的长时间操作时间的限制。具体来说,第二个细胞捕获只能在24小时后将第一个捕获的细胞附着在表面后进行。 赵等人报告了一种基于液滴的微流体装置,以捕获两种类型的单个细胞13。可以发现,液滴基微流体装置仍局限于泊液分布,只能在非附着细胞上使用,在培养过程中无法改变培养液。
此前,我们已经开发出一种微流体”流体动力学穿梭芯片”,利用确定性流体动力将多种类型的单细胞捕获到培养室中,并随后进行细胞共培养实验以进行分析细胞-细胞相互作用下的单个细胞迁移行为14。流体动力穿梭芯片包括一组阵列单元,每个单元包含蛇形通路通道、捕获场和培养室。通过使用蛇形通路通道和培养室之间的流动电阻差,以及专门设计的操作程序,不同类型的单细胞可以反复捕获到培养室中。值得注意的是,培养室的充足空间不仅可以防止细胞在细胞捕获过程中被冲洗,而且为细胞扩散、增殖和迁移提供了足够的空间,从而可以观察活的单细胞相互作用。在本文中,我们将重点介绍此设备的生产和详细的协议步骤。
肿瘤微环境中各种细胞间的相互作用对肿瘤17的进展起着重要作用。为了理解细胞-细胞相互作用的机制,共培养系统作为一种常见的分析方法。然而,多种细胞类型和细胞本身的异质性导致了实验的复杂性和分析困难。
流体动力穿梭芯片允许通过确定性方法在培养室中进行多个单元加载,而不受稀释方法和微孔平台中的泊森分布限制的限制。通过提供高三?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了科技部(105-2628-E-400-001-MY2)和组织工程和再生医学博士项目、国立中兴大学和国家卫生研究院的资助。
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |