Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico
Summary
Este informe describe un método microfluídico basado en chips para establecer un experimento de cultivo de una sola célula en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de varias células individuales.
Abstract
Los ensayos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para estudiar las interacciones de células celulares entre diferentes tipos de células para comprender mejor la biología de las enfermedades, incluido el cáncer. Sin embargo, es difícil aclarar el complejo mecanismo de interacciones intercelulares en poblaciones celulares altamente heterogéneas utilizando sistemas de cocultivo convencionales porque la heterogeneidad de la subpoblación celular está oscurecida por los valores medios; los sistemas de cocultivo convencionales sólo se pueden utilizar para describir la señal de población, pero son incapaces de rastrear el comportamiento de las células individuales. Además, los métodos experimentales convencionales de una sola célula tienen baja eficiencia en la manipulación celular debido a la distribución de Poisson. Los dispositivos microfabricados son una tecnología emergente para estudios de una sola célula porque pueden manipular con precisión células individuales a un alto rendimiento y pueden reducir el consumo de muestras y reactivos. Aquí, describimos el concepto y la aplicación de un chip microfluídico para múltiples cocultivos de una sola célula. El chip puede capturar de manera eficiente varios tipos de células individuales en una cámara de cultivo (46%) y tiene un espacio de cultivo suficiente útil para estudiar el comportamiento de las células (por ejemplo, migración, proliferación, etc.) bajo la interacción célula-célula a nivel de una sola célula. Las células endoteliales linfáticas y el carcinoma de células escamosas orales se utilizaron para realizar un experimento de cocultivo de una sola célula en la plataforma microfluídica para estudios de interacción de células únicas en vivo.
Introduction
Se necesita una captura eficiente de diferentes tipos de celdas individuales y proporcionar suficiente espacio de cultivo para experimentos de cocultivo de una sola célula de varios tipos de celdas individuales1. Limitar la dilución es el método más utilizado para preparar las células individuales para tales experimentos, debido al bajo costo del equipo requerido. Sin embargo, debido a la limitación de distribución de Poisson, la probabilidad máxima de adquisición de una sola célula es de solo 37%, lo que hace que la operación experimental sea laboriosa y requiera mucho tiempo2. Por el contrario, el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede superar la limitación de distribución de Poisson para preparar de manera alta células individuales3. Sin embargo, es posible que algunos laboratorios no puedan acceder a FACS debido a los costosos costos de instrumentación y mantenimiento. Los dispositivos microfabricados se han desarrollado recientemente para el reventado de una sola célula4,el emparejamiento de una sola célula5y las aplicaciones de cultivo de una sola célula. Estos dispositivos son ventajosos en función de su capacidad para manipular con precisión celdas individuales6,realizar experimentos de alto rendimiento o reducir el consumo de muestras y reactivos. Sin embargo, realizar experimentos de cocultivo de una sola célula con varios tipos de células con los dispositivos microfluídicos actuales sigue siendo un desafío debido a la limitación de la distribución de Poisson1,7,8,o la incapacidad de los dispositivos para capturar más de dos tipos de células individuales4,5,6,9,10.
Por ejemplo, Yoon y otros informaron de un dispositivo microfluídico para el estudio de interacción célula-célula11. Este dispositivo utiliza el método probabilístico para emparejar celdas en una cámara. Sin embargo, sólo puede lograr el emparejamiento de dos tipos de celda diferentes debido a restricciones geométricas en la estructura del dispositivo. Otro informe de Lee y otros demostró un método determinista para capturar y emparejar celdas individuales12. Este dispositivo aumenta la eficiencia de emparejamiento por el método determinista, pero está limitado por el tiempo de operación prolongado necesario para emparejar celdas. Específicamente, la segunda captura de célula sin capacidad sólo se puede realizar después de que la primera celda capturada se une a la superficie después de 24 h. Zhao et al. informaron de un dispositivo microfluídico basado en gotas para capturar dos tipos de una sola celda13. Podemos encontrar que el dispositivo microfluídico basado en gotas todavía se limita a la distribución de Poisson y sólo se puede utilizar en células no conectadas, y no es posible cambiar la solución de cultivo durante el proceso de cultivo.
Anteriormente, hemos desarrollado un microfluido “chip de cierre hidrodinámico” que utiliza fuerzas hidrodinámicas deterministas para capturar múltiples tipos de una sola célula en la cámara de cultivo y posteriormente puede realizar experimentos de cocultivo celular para analizar comportamiento de migración de celda sindividual en las interacciones de célulascelulares 14. El chip de cierre hidrodinámico comprende un conjunto de unidades de matriz que cada una contiene un canal de derivación de serpentina, un sitio de captura y una cámara de cultivo. Mediante el uso de la diferencia en la resistencia al flujo entre el canal de derivación de serpentina y la cámara de cultivo, y un procedimiento de operación especialmente diseñado, diferentes tipos de células individuales se pueden capturar repetidamente en la cámara de cultivo. En particular, el amplio espacio de la cámara de cultivo no sólo puede evitar que la célula se enjuague durante la captura de células, sino que también proporcione suficiente espacio para que las células se propaguen, proliferen y migren, lo que permite observar interacciones en vivo de una sola célula. En este artículo, nos centramos en la producción de este dispositivo y los pasos detallados del protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las interacciones intercelulares de varias células en el microambiente tumoral juegan un papel importante en la progresión del tumor17. Para comprender el mecanismo de las interacciones célula-célula, los sistemas de cocultivo se utilizan como un método analítico común. Sin embargo, múltiples tipos de células y la heterogeneidad de las propias células han llevado a complejidad experimental y dificultades analíticas.
El chip de cierre hidrodinámico permite la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología (105-2628-E-400-001-MY2), y el Programa de Doctorado en Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa, national Chung Hsing University e National Health Research Institutes.
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
Referências
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