In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Summary

Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

Abstract

Décadas de investigación en muchos organismos modelo han llevado al concepto actual de plasticidad sináptica subyacente al aprendizaje y la formación de la memoria. Los cambios inducidos por el aprendizaje en la transmisión sináptica a menudo se distribuyen a través de muchas neuronas y niveles de procesamiento en el cerebro. Por lo tanto, se necesitan métodos para visualizar la plasticidad sináptica dependiente del aprendizaje a través de las neuronas. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster representa un organismo modelo particularmente favorable para estudiar los circuitos neuronales subyacentes al aprendizaje. El protocolo presentado aquí demuestra una manera en que los procesos subyacentes a la formación de memorias olfativas asociativas, es decir, la actividad sináptica y sus cambios, pueden ser monitoreados in vivo. Utilizando la amplia gama de herramientas genéticas disponibles en Drosophila,es posible expresar específicamente indicadores de calcio codificados genéticamente en poblaciones celulares determinadas e incluso células individuales. Mediante la fijación de una mosca en su lugar, y la apertura de la cápsula de la cabeza, es posible visualizar la dinámica de calcio en estas células mientras se entregan estímulos olfativos. Además, demostramos una configuración en la que la mosca puede ser sometida, simultáneamente, a descargas eléctricas al cuerpo. Esto proporciona un sistema en el que las moscas pueden someterse a un acondicionamiento olfativo clásico – por el cual se aprende a asociar un olor previamente ingenuo con el castigo por descarga eléctrica – al mismo tiempo que la representación de este olor (y otros olores no entrenados) es observada en el cerebro a través de una microscopía de dos fotones. Nuestro laboratorio ha informado previamente de la generación de sensores de calcio localizados sinaptically, lo que permite limitar las señales de calcio fluorescente a compartimentos pre o postsinápticos. La microscopía de dos fotones proporciona una manera de resolver espacialmente estructuras finas. Ejemplificamos esto centrándonos en las neuronas que integran información del cuerpo de la seta, un centro de orden superior del cerebro de insectos. En general, este protocolo proporciona un método para examinar las conexiones sinápticas entre las neuronas cuya actividad se modula como resultado del aprendizaje olfativo.

Introduction

Descifrar dónde y cómo se adquiere la información en el cerebro a través del aprendizaje y posteriormente se almacena como memoria constituye una de las tareas más desafiantes en neurociencia¹. La investigación neurocientífica ha llevado al concepto de un cambio en la transmisión sináptica como el sustrato neuronal que subyace al aprendizaje y la formación de la memoria^2,3. Se presume que, durante el aprendizaje, las conexiones sinápticas entre los conjuntos neuronales que están activos durante la percepción de un estímulo se modifican de tal manera que su patrón de actividad combinado puede ser recuperado durante la memoria, instruyendo así acción conductual futura⁴. Estas “células de engrama” y sus sinapsis se distribuyen a menudo entre las regiones cerebrales y los niveles de procesamiento, lo que hace difícil asignar los cambios observados en la transmisión sináptica al aprendizaje de una tarea o un estímulo. Para localizar y visualizar los cambios sinápticos que están vinculado causalmente a una tarea de aprendizaje específica se necesita un sistema modelo adecuado que permita precisamente el confinamiento de esas sinapsis.

Para tal esfuerzo, Drosophila melanogaster es particularmente adecuado porque combina simplicidad cerebral relativa, riqueza conductual y accesibilidad experimental. Entre los organismos modelo bien establecidos, Drosophila está situado entre el nematodo C. elegans y mamíferos genéticamente tractables como ratones en términos de complejidad neuronal. El número estereotípico de neuronas (300) y el repertorio de comportamiento limitado se observa en C. elegans. Los mamíferos, por otro lado, tienen millones de neuronas y una complejidad conductual asombrosa. El cerebro de la mosca de la fruta es, con sus 100.000 euros, neuronas significativamente más pequeñas que los cerebros de la mayoría de los vertebrados, y muchas de las neuronas son identificables individualmente⁵. Sin embargo, Drosophila demuestra un amplio espectro de comportamientos complejos, incluyendo la capacidad de exhibir un sólido aprendizaje olfativo asociativo y la formación de la memoria, descrito por primera vez hace más de 40 años⁶. En el curso de este procedimiento de acondicionamiento clásico, los grupos de moscas son sometidos a un olor como estímulo condicionado (CS⁺) mientras reciben una descarga eléctrica castigadora como estímulo incondicional (EE.UU.). Un segundo olor (CS^–) se presenta sin ningún castigo. De este modo, los animales aprenden a evitar el olor asociado con el castigo, que se puede probar en una situación de elección posterior entre los dos olores, CS⁺ y CS^–. El trabajo en la disección del sustrato neuronal subyacente a este comportamiento en Drosophila ha identificado los cuerpos de setas (MB) como el sitio primario del “engram”^7,8,9,10 y, por lo tanto, el circuito de esta región cerebral fue y es objeto de intensa investigación con el fin de descubrir la lógica por la que se adquiere y almacena un engrama de memoria (revisado recientemente en^11,12).

La Drosophila MB se compone de 2.000 neuronas intrínsecas (células de Kenyon) por hemisferio, organizadas en proyecciones axonales paralelas^13. Los axones de neuronas de proyección olfativa se extienden a la protocerebra lateral y a los cálices MB, el principal sitio de entrada dendrítica del MB y reciben la entrada olfativa de los lóbulos antenales. El largo y paralelo haz de axons de células Kenyon constituyen el pedúnculo y los lóbulos. La mayoría de las células de Kenyon se bifurcan formando lóbulos horizontales de los lóbulos de la parte media del cerebro, y los lóbulos verticales de los lóbulos de la línea central de la región, extendiendo la segunda proyección colateral en la dirección dorsal-anterior. El otro grupo de células de Kenyon forma los lóbulos horizontales¹³ del MB donde el proceso de aprendizaje y la posterior formación de la memoria a corto plazo podrían ser localizados¹⁰. Los lóbulos MB reciben una entrada aferente y proporcionan una salida eferente, que normalmente están restringidas a subregiones compartimentales distintas a lo largo de los axons de celda Kenyon^14,15,16. En particular, se ha demostrado que las neuronas de entrada dopaminérgicas aferentas MB median en medios basados en valores, por ejemplo, efectos punitivos y de refuerzo en el aprendizaje olfativo asociativo^15,17. Las neuronas de salida estereotípicas efusivas y efusivas MB de los lóbulos del cuerpo de la seta integran información a través de un gran número de células Kenyon, se dirigen a diversas áreas cerebrales y llevan información apologiva o aversiva al comportamiento¹⁵ . Esta arquitectura neuronal ha llevado a un concepto de la organización del engrama asociativo. Los olores son codificados con relativa precisión por conjuntos escasamente activados de células Kenyon. La actividad coincidente de estos conjuntos celulares de Kenyon y la liberación de dopamina – evocado por estímulos castigadores – modula la transmisión de la célula de Kenyon presinapnaftas en las neuronas de salida MB de modo que los animales posteriormente evitarán este olor en particular^{10 ,12}. Usamos este engrama bastante preciso definido y localizado como un caso paradigmático para ilustrar cómo se pueden determinar y supervisar estos cambios dependientes del aprendizaje en la actividad sináptica.

El valor de Drosophila como sistema modelo se basa en gran medida en la caja de herramientas genética sin igual que permite expresar transgenes para identificar, monitorear y controlar neuronas individuales dentro de circuitos complejos^18. El advenimiento de técnicas para el monitoreo de la actividad neuronal -como la toma de imágenes de calcio, discutida aquí- ha permitido la determinación de patrones de actividad neuronal en respuesta a un estímulo específico. Mediante la combinación de la expresión específica impulsada por Gal4 de indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) con estimulación olfativa, se puede visualizar la dinámica de calcio evocada por olores de las neuronas de interés¹⁹. En este protocolo, se demuestra que al acoplar aún más esta técnica con un paradigma de acondicionamiento clásico, es posible examinar estas respuestas olfativas en el contexto del aprendizaje. La plasticidad inducida por el aprendizaje se puede diseccionar aún más utilizando GECI que no solo se localizan en una sola neurona específica, sino también en subcompartimentos específicos de una neurona. ²⁰ establecieron una selección de herramientas que permiten exactamente esto. Al dirigir setrata de GCaMP3²¹ a la pre- o postsina) – a través de la vinculación con el vertebrado Synaptophysin o dHomer, respectivamente²⁰– se puede distinguir la modulación diferencial de estos sitios. Esta localización confiere, en este contexto, una ventaja sobre la mayoría de las GECI que están presentes omnipresentes en todo el citosol – por ejemplo, GCaMP^22,GCaMP3²¹o GCaMP6²³ – porque significa que los transitorios pre y postsinápticos pueden ser transitorios distinguida de la influjo de calcio integrado general que se produce como resultado de la activación de la neurona. Esto puede proporcionar pistas sobre la ubicación y los tipos de plasticidad que se producen como resultado de o que causan el aprendizaje y la formación de la memoria. Como ejemplo, el protocolo proporcionado aquí muestra el valor de esta herramienta para descifrar la modulación de las neuronas de salida MB durante el aprendizaje asociativo olfativo dirigiendo la expresión del sensor de calcio a sólo la postsinapsis. Mediante el monitoreo, dentro de una mosca individual, la actividad evocada por olores antes y después del acondicionamiento olfativo se puede extraer una comparación directa entre una respuesta de olor ingenua y una respuesta de olor aprendido. Mientras se fijan en la misma cámara de imágenes, las moscas se exponen a una selección de olores. A continuación, reciben un protocolo de acondicionamiento asociativo aversivo en el que uno de estos olores se combina con la descarga eléctrica (convirtiéndose en el CS⁺) y otro olor se presenta sin refuerzo (convirtiéndose en el CS^–). Finalmente, las moscas se exponen de nuevo a los mismos olores que en el primer paso. La dinámica del calcio se observa mediante microscopía de dos fotones.

Protocol

1. Moscas de la fruta transgénicas, Drosophila melanogaster Cruzar moscas vírgenes y machos hembras (elevadas a 25oC en 60% de humedad relativa en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h) llevando las construcciones deseadas de Gal4 y UAS25,respectivamente, para producir moscas en las que neuronas específicas de interés expresan una indicador de calcio. Envejecer la progenie femenina de la cruz anterior hasta que estén en el rango de 3-6 días después de la eclosión. …

Representative Results

Un ejemplo de las imágenes adquiridas con el protocolo antedicho se puede ver en el cuadro 2. d Homer-GCaMP3 se expresa en una neurona de salida MB cuyas dendritas infunden el compartimiento 1 del lóbulo MB (la neurona se denomina MVP228,29)y está dirigida genéticamente utilizando la línea split-Gal4 MB112C16. También, se demuestra la diferencia en la localizaci?…

Discussion

La disección de los circuitos neuronales subyacentes al aprendizaje y la memoria es un objetivo prominente en el campo de la neurociencia. La accesibilidad genética de Drosophila y la amplitud y facilidad de las pruebas conductuales hacen de esta una herramienta ideal para investigar este tipo de fenómenos. Aquí, se presenta un método con el que es posible visualizar, dentro de moscas individuales, la modulación que se produce a un nivel subcelular como resultado del acondicionamiento olfativo. Mediante la…

Materials

1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape	Tesa SE, Norderstedt, Germany		Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	10053-09	Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	11412-11	Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle	Sterican – B. Braun, Melsungenk, Germany	4665120	1.20x40mm
Insect Minutien pins	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	26002-10	Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blue light-curing glue
Microscope slide	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	0656.1	Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution	n.a.	n.a.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Product No. 11
Surgical scalpel handle	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope.	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.