पांच कशेरुकी समूहों में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र माइक्रोवेसल्स का विश्वसनीय अलगाव
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य लिसेंसेफेलिक और जायरेंसेफलिक कशेरुकी के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कई क्षेत्रों से माइक्रोवेसल्स को अलग करना है।
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से सूक्ष्म जहाजों का अलगाव आमतौर पर कई जानवरों से कॉर्टिकल ऊतक के संयोजन से किया जाता है, अक्सर कृंतक। यह दृष्टिकोण कॉर्टेक्स के लिए रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) गुणों की पूछताछ को सीमित करता है और व्यक्तिगत तुलना के लिए अनुमति नहीं देता है। यह परियोजना एक अलगाव विधि के विकास पर केंद्रित है जो कई सीएनएस क्षेत्रों से न्यूरोवैस्कुलर यूनिट (एनवीयू) की तुलना के लिए अनुमति देती है: कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ऑप्टिक पालि, हाइपोथैलेमस, पिट्यूटरी, ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी। इसके अलावा, मूल रूप से मूत्र के नमूनों के लिए विकसित इस प्रोटोकॉल को छोटे और बड़े कशेरुकी प्रजातियों से सीएनएस ऊतकों पर उपयोग के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया था, जिसमें से हम मस्तिष्क गोलार्द्ध सफेद पदार्थ से सूक्ष्म जहाजों को अलग करने में भी सक्षम हैं। यह विधि, इम्यूनोलेबलिंग के साथ जोड़े जाने पर, प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा और व्यक्तियों, ऊतक प्रकार या उपचार के बीच सांख्यिकीय तुलना की अनुमति देती है। हमने प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईएई), न्यूरोफ्लेमेटरी रोग, मल्टीपल स्क्लेरोसिस के एक मूत्र मॉडल के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का मूल्यांकन करके इस प्रयोज्यता को साबित किया। इसके अतिरिक्त, इस विधि से अलग किए गए माइक्रोवेसल्स का उपयोग क्यूपीसीआर, आरएनए-सीक्यू और पश्चिमी दाग जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। हालांकि अल्ट्रासेंट्रियूज़ेशन या एंजामेटिक विच्छेदन के उपयोग के बिना सीएनएस माइक्रोवेसल्स को अलग करने का यह पहला प्रयास नहीं है, यह एकल व्यक्तियों और कई सीएनएस क्षेत्रों की तुलना के लिए अपनी माहिरता में अद्वितीय है। इसलिए, यह मतभेदों की एक श्रृंखला की जांच के लिए अनुमति देता है जो अन्यथा अस्पष्ट रह सकते हैं: सीएनएस भाग (कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, ऑप्टिक पालि, ब्रेनस्टेम, हाइपोथैलेमस, पिट्यूटरी, और रीढ़ की हड्डी), सीएनएस ऊतक प्रकार (ग्रे या सफेद पदार्थ), व्यक्ति, प्रयोगात्मक उपचार समूहों, और प्रजातियों।
Introduction
हमारा मस्तिष्क हमारे शरीर में सबसे महत्वपूर्ण अंग है। इस कारण से, बाहरी कारकों के बावजूद मस्तिष्क होमोस्टोसिस रखना जो सामान्य स्थिति से विचलन को ट्रिगर कर सकता है, एक प्राथमिकता है। कुछ विद्वानों के अनुसार, लगभग 400-500 मिलियन साल पहले1,कशेरुकी जानवरों का विकास किया गया जो अब हम रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी)2,3के रूप में जानते हैं। यह सुरक्षात्मक “बाड़” रक्त और सीएनएस परन्चिमा के बीच आयनों, अणुओं और कोशिकाओं के परिवहन को कसकर विनियमित करके केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) होमोस्टोसिस और कार्यों पर सबसे बड़ा प्रभाव डालती है। जब बीबीबी बाधित होता है, तो मस्तिष्क विषाक्त जोखिम, संक्रमण और सूजन के लिए अतिसंवेदनशील हो जाता है। इसलिए, बीबीबी रोग कई लोगों के साथ जुड़ा हुआ है, यदि सभी नहीं, न्यूरोलॉजिकल और न्यूरोडेवलपमेंटल विकार4,5,6।
बीबीबी के परिष्कृत कार्य को न्यूरोवैस्कुलर यूनिट (एनवीयू)2,3द्वारा अनुरूप अद्वितीय सीएनएस माइक्रोवेस्कुल्चर के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। अत्यधिक विशेष एंडोथेलियल कोशिकाएं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइटिक एंड-फीट एनवीयू2,3के सेलुलर घटक हैं। इन कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न अतिरिक्त मैट्रिक्स एनवीयू और बीबीबी फिजियोलॉजी2,3के लिए भी आवश्यक है । यद्यपि एनवीयू के आवश्यक सेलुलर और आणविक घटकों को कशेरुकी के बीच संरक्षित किया जाता है, लेकिन7,8आदेशोंऔर प्रजातियों के बीच विषमता की सूचना दी जाती है। हालांकि, तकनीकी सीमाएं न्यूरोबायोलॉजी, बायोमेडिकल या ट्रांसलेशनल अनुसंधान में इन मतभेदों पर पूरी तरह से विचार करने की हमारी क्षमता में बाधा डालती हैं।
इस वजह से, हमने एक सीएनएस क्षेत्र-विशिष्ट माइक्रोवेसल-आइसोलेशन विधि का विस्तार किया ताकि इसे सभी पांच कशेरुकी समूहों से कई प्रजातियों पर लागू किया जा सके: मछली, उभयचर, सरीसृप, पक्षी और स्तनधारी। प्रोटोकॉल को छोटे-लिसेसेफेलिक और बड़े-जायरेंसेफेलिक कशेरुकी पर उपयोग के लिए वर्णित किया गया है, जिसमें अनुवादप्रासंगिक प्रासंगिकता9वाली प्रजातियां शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, हम सीएनएस के अन्य क्षेत्रों को इस संदर्भ में पहले जांच नहीं करते हैं, लेकिन न्यूरोफिजियोलॉजी के लिए प्रासंगिक और जबरदस्त नैदानिक प्रभावों के साथ: हाइपोथैलेमस, पीयूष और सफेद पदार्थ। अंत में, हमने एनवीयू और/या बीबीबी9,10,11के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में इस अलगाव विधि की क्षमता का परीक्षण किया । एक सबूत की अवधारणा के रूप में, हमने दिखाया कि प्रतिरक्षण के बाद अलगाव विधि का उपयोग करई के दौरान वीसीएएम-1 और जैम-बी अभिव्यक्ति में परिवर्तन कैसे निर्धारित किया जाए।
Protocol
Representative Results
Discussion
बीबीबी में मस्तिष्क माइक्रोवेकुल्चर एंडोथेलियल कोशिकाओं के अद्वितीय गुण शामिल हैं, जो तंग-, अनुयायियों-, “खूंटी-सॉकेट”-जंक्शनों, और सीएनएस होमोस्टोसिस2,3,19के लिए महत्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डॉ क्रूज़-Orengo कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस, पशु चिकित्सा शुरू धन के स्कूल द्वारा समर्थित था ।
Materials
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
Referências
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