Préparation de surface cochléaire dans la souris adulte
Summary
Cet article présente une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire qui exige la décalcification et l’utilisation d’un adhésif de cellules et de tissu pour adhérer aux morceaux d’épithélium cochléaire aux feuillets ronds de couverture de 10 mm pour l’immunohistochimie dans les cochléées adultes de souris.
Abstract
Le traitement auditif de la cochlée dépend de l’intégrité des cellules ciliées mécanosensorielles. Au cours d’une vie, la perte auditive peut être acquise à partir de nombreuses étiologies telles que l’exposition à un bruit excessif, l’utilisation de médicaments ototoxiques, les infections bactériennes ou virales de l’oreille, les traumatismes crâniens et le processus de vieillissement. La perte de cellules ciliées sensorielles est une caractéristique pathologique commune des variétés de perte auditive acquise. En outre, la synapse de cellules de cheveux internes peuvent être endommagées par des insultes légères. Par conséquent, les préparations de surface de l’épithélie cochléaire, en combinaison avec les techniques d’étiquetage immunoetsetaux et l’imagerie confocale, sont un outil très utile pour l’étude des pathologies cochléaires, y compris les pertes de synapses de ruban et de cellules capillaires sensorielles, changements des niveaux de protéines dans les cellules ciliées et les cellules de soutien, la régénération des cellules ciliées et la détermination de l’expression du gène de rapport (c.-à-d., GFP) pour la vérification de la transduction réussie et l’identification des types de cellules transductées. La cochlée, une structure osseuse en forme de spirale dans l’oreille interne, détient l’organe auditif de fin sensorielle, l’organe de Corti (OC). Les cellules ciliées sensorielles et les cellules de soutien environnantes dans le CO sont contenues dans le conduit cochléaire et reposent sur la membrane basilaire, organisée de façon tonotopique avec détection à haute fréquence se produisant dans la base et basse fréquence dans l’apex. Avec la disponibilité de l’information moléculaire et génétique et la capacité de manipuler des gènes par KO et knock-in techniques, les souris ont été largement utilisés dans la recherche biologique, y compris dans la science de l’audition. Cependant, la cochlée de souris adulte est minuscule, et l’épithélium cochléaire est encapsulé dans un labyrinthe osseux, rendant la microdissection difficile. Bien que des techniques de dissection aient été développées et utilisées dans de nombreux laboratoires, cette méthode modifiée de microdissection utilisant l’adhésif de cellules et de tissu est plus facile et plus commode. Il peut être utilisé dans tous les types de cochlée de souris adultes après la décalcification.
Introduction
La cochlée est dédiée à la détection du son et responsable de l’audition. Le conduit cochléaire est enroulé dans une forme spirale dans le labyrinthe osseux et tient l’organe d’extrémité sensorielle auditive, l’organe de Corti (OC). Le CO repose sur la membrane basilaire, constituant l’épithélium cochléaire, d’une longueur d’environ 5,7 mm lorsqu’il est désenroulé chez les souris adultes CBA/ CaJ1,2. Parce que le CO est tonotopiquement organisé avec des hautes fréquences détectées dans la base et les basses fréquences dans l’apex, l’épithélium cochléaire est souvent divisé en trois parties pour des comparaisons analytiques: les tours asphériques, moyens et basaux correspondant à faible, détection moyenne et haute fréquence, respectivement. En plus d’un éventail de cellules de soutien, le CO est composé d’une rangée de cellules ciliées internes (IHC) situées médially et de trois rangées de cellules ciliées externes (CCO) situées latéralement par rapport à la spirale cochléaire.
Le traitement auditif correct dépend de l’intégrité des cellules ciliées sensorielles dans la cochlée. Les dommages ou la perte de cellules ciliées sensorielles sont une caractéristique pathologique commune de la perte auditive acquise, causée par de nombreuses étiologies telles que l’exposition à un bruit excessif, l’utilisation de médicaments ototoxiques, les infections bactériennes ou virales de l’oreille, les traumatismes crâniens et le vieillissement processus3. En outre, l’intégrité et la fonction de la cellule capillaire interne / synapses nerveuses auditives peuvent être altérées par des insultes légères4. Avec la disponibilité de l’information moléculaire et génétique et la manipulation des gènes par KO et knock-in techniques, les souris ont été largement utilisés dans la science de l’audition. Bien que la cochlée adulte de souris soit minuscule et que l’épithélium cochléaire soit entouré d’une capsule osseuse entraînant des microdissections techniquement difficiles, des préparations de surface de l’épithélium en combinaison avec l’immunolabeling ou l’immunohistochimie et l’imagerie confocale ont été largement utilisées pour l’étude des pathologies cochléaires, y compris les pertes de synapses de ruban et de cellules ciliées, les changements dans les niveaux de protéines dans les cellules ciliées sensorielles et les cellules de soutien, et la régénération des cellules capillaires. Des préparations de surface cochléaires ont également été utilisées pour déterminer le modèle d’expression des gènes des journalistes (c.-à-d. GFP) et confirmer la transduction réussie et identifier les types de cellules transductées. Ces techniques ont été précédemment utilisées pour l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à la perte auditive induite par le bruit à l’aide de souris adultes CBA / J5,6,7,8,9.
Contrairement à l’immunohistochimie utilisant des sections de paraffine ou des cryosections pour obtenir de petites parties transversales de la cochlée qui contiennent trois cellules ciliées externes (CCO) et une cellule capillaire interne (IHC) sur chaque section, les préparations de surface cochléaire permettent visualisation de toute la longueur de l’OC pour le comptage des cellules ciliées sensorielles et des synapses de ruban et de l’immunolabeling des cellules ciliées sensorielles correspondant à des fréquences fonctionnelles spécifiques. Le tableau 1 montre la cartographie des fréquences auditives en fonction de la distance le long de la spirale cochléaire chez la souris adulte CBA/J selon des études de Muller1 et Viberg et Canlon1,2. Les préparations de surface cochléaires ont été largement utilisées pour l’étude des pathologies cochléaires4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. La méthode de dissection cochléaire à monture entière a été décrite à l’origine dans un livre édité par Hans Engstrom en 196616. Cette technique a ensuite été affinée et adaptée à une variété d’espèces telles que décrites dans la littérature par un certain nombre de scientifiques en sciences de l’audition10,11,12,13, 15,17 et par les laboratoires Eaton-Peabody au Massachusetts Eye and Ear18. Récemment, une autre méthode de dissection cochléaire a été rapportée par Montgomery et coll.19. La microdissection de la cochlée est une étape essentielle et critique pour les préparations de surface cochléaires. Cependant, disséquer les cochléées de souris est un défi technique et nécessite une pratique considérable. Ici, une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire est présentée pour une utilisation dans les cochléae adultes de souris. Cette méthode nécessite la décalcification et l’utilisation d’adhésif cellulaire et tissulaire (c.-à-d. Cell-Tak) pour adhérer aux morceaux d’épithélium cochléaire à des couvertures rondes de 10 mm pour l’immunoétiquetage. L’adhésif de cellules et de tissu a été employé couramment pour l’immunohistochimie20. Cette méthode de microdissection cochléaire modifiée est relativement simple par rapport à celles précédemment rapportées18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microdissection cochléaire des préparations de surface de montage entier en combination avec l’immunolabeling fournit un outil de base pour l’étude des pathologies d’oreille interne et des mécanismes moléculaires. Cette méthode de dissection cochléaire de souris adulte modifiée utilisant l’adhésif de cellules et de tissu simplifie cette procédure difficile.
Bien que cette méthode modifiée de préparation de surface cochléaire soit relativement facile et accessible, elle nécess…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet de recherche décrit a été soutenu par la subvention R01 DC009222 du National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Ces travaux ont été réalisés dans l’édifice WR du MUSC dans un espace rénové soutenu par la subvention C06 RR014516. Les animaux ont été logés dans des installations musC CRI pour animaux, appuyés par la subvention C06 RR015455 du Programme des installations de recherche extra-muros du National Center for Research Resources. Les auteurs remercient le Dr Jochen Schacht pour ses précieux commentaires et Andra Talaska pour la relecture du manuscrit.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
Referências
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