Cochleaire oppervlakte voorbereiding in de volwassen muis
Summary
Dit artikel presenteert een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode die de decalcificatie en het gebruik van een cel en weefsellijm vereist om de stukjes cochleaire epitheel te hechten aan 10 mm ronde afdek stroken voor immunohistochemie in volwassen muis cochleae.
Abstract
Auditieve verwerking in de slakkenhuis hangt af van de integriteit van de mechanosensorische haarcellen. Gedurende een leven kan gehoorverlies worden verkregen uit tal van etiologie, zoals blootstelling aan overmatig lawaai, het gebruik van ototoxische medicatie, bacteriële of virale oorontstekingen, hoofd blessures en het verouderingsproces. Verlies van sensorische haarcellen is een veel voorkomend pathologisch kenmerk van de variëteiten van verworven gehoorverlies. Bovendien kan de binnenste Haarcel Synapse worden beschadigd door milde beledigingen. Daarom zijn oppervlakte preparaten van cochleaire epithei, in combinatie met immunolabeling-technieken en confocale beelden, een zeer nuttig hulpmiddel voor het onderzoek naar cochleaire pathologieën, inclusief het verlies van lint synapsen en sensorische haarcellen, veranderingen in de eiwit spiegels in haarcellen en ondersteunende cellen, haarcelregeneratie en de bepaling van de genexpressie van het rapport (d.w.z. GFP) voor de verificatie van succesvolle transductie en identificatie van getransduceerde celtypen. De cochlea, een Bony spiraalvormige structuur in het binnenoor, houdt het auditieve sensorische eind orgaan, het orgaan van Corti (OC). Sensorische haarcellen en omringende ondersteunende cellen in de OC zijn opgenomen in het cochleair kanaal en rusten op het basilaire membraan, georganiseerd in een tonotopische mode met hoogfrequente detectie die optreedt in de basis en lage frequentie in de Apex. Met de beschikbaarheid van moleculaire en genetische informatie en de mogelijkheid om genen te manipuleren door knockout en knock-in technieken, zijn muizen op grote schaal gebruikt in biologisch onderzoek, inclusief in de hoorwetenschap. Echter, de volwassen muis slakkenhuis is miniscule, en het cochleaire epitheel is ingekapseld in een Bony labyrint, waardoor micro dissectie moeilijk. Hoewel dissectie technieken zijn ontwikkeld en gebruikt in vele laboratoria, deze gemodificeerde microdissection methode met behulp van cel en weefsellijm is gemakkelijker en handiger. Het kan worden gebruikt in alle soorten volwassen muis cochleae na decalcificatie.
Introduction
De slakkenhuis is gewijd aan het opsporen van geluid en verantwoordelijk voor het horen. Het cochleaire kanaal wordt in een spiraalvorm in het Bony labyrint gewikkeld en houdt het auditieve sensorische eind orgaan, het orgaan van Corti (OC). De OC berust op het basilaire membraan, waaruit het cochleaire epitheel bestaat, met een lengte van ongeveer 5,7 mm wanneer het niet is opgerold bij volwassen CBA/CAJ muizen1,2. Omdat de OC tonotopisch georganiseerd is met hoge frequenties gedetecteerd in de basis en lage frequenties in de Apex, wordt het cochleaire epitheel vaak onderverdeeld in drie delen voor analytische vergelijkingen: de apicale, middelste en basale bochten die corresponderen met laag, middelste en hoogfrequente detectie. Naast een reeks ondersteunende cellen, bestaat de OC uit een rij binnenste haarcellen (Ihc’s) die zich mediaal en drie rijen buitenste haarcellen (Ohc’s) bevinden, die zich lateraal bevinden ten opzichte van de cochleaire spiraal.
De juiste auditieve verwerking is afhankelijk van de integriteit van de sensorische haarcellen in de cochlea. Beschadiging of verlies van sensorische haarcellen is een veel voorkomend pathologisch kenmerk van verworven gehoorverlies, veroorzaakt door tal van etiologieën zoals blootstelling aan overmatig lawaai, het gebruik van ototoxische medicatie, bacteriële of virale oorontstekingen, hoofdletsel en de veroudering proces3. Bovendien kan de integriteit en functie van de binnenste haar cel/auditieve zenuw synapsen worden aangetast door milde insulten4. Met de beschikbaarheid van moleculaire en genetische informatie en manipulatie van genen door knockout en knock-in technieken, zijn muizen op grote schaal gebruikt in de hoorwetenschap. Hoewel de volwassen muis slakkenhuis minuscule is en het cochleaire epitheel is omgeven door een Bony capsule, wat resulteert in technisch moeilijke micro dissecties, oppervlakte preparaten van het epitheel in combinatie met immunolabeling of immunohistochemie en confocale beelden zijn breed gebruikt voor onderzoek naar cochleaire pathologieën, met inbegrip van verliezen van lint synapsen en haarcellen, veranderingen in de niveaus van eiwitten in sensorische haarcellen en ondersteunende cellen, en haar celregeneratie. Er zijn ook cochleaire oppervlakte preparaten gebruikt om het patroon van de expressie van reporter genen (d.w.z. GFP) te bepalen en succesvolle transductie te bevestigen en getransduceerde celtypen te identificeren. Deze technieken zijn eerder gebruikt voor de studie van moleculaire mechanismen onderliggend gehoorverlies met behulp van volwassen CBA/J muizen5,6,7,8,9.
In tegenstelling tot immunohistochemie die paraffine secties of cryosecties gebruikt om kleine transversale delen van het slakken hoofd te verkrijgen die drie buitenste haarcellen (Ohc’s) en één binnenste Haarcel (IHC) op elke sectie bevatten, kunnen cochleaire oppervlakte preparaten visualisatie van de volledige lengte van de OC voor het tellen van sensorische haarcellen en lint synapsen en immunolabeling van sensorische haarcellen overeenkomend met specifieke functionele frequenties. Tabel 1 toont de toewijzing van hoorfrequenties als een functie van afstand over de lengte van de cochleaire spiraal in volwassen CBA/J-muis volgens studies van Muller1 en Viberg en canlon1,2. Cochleaire oppervlakte preparaten worden op grote schaal gebruikt voor onderzoek naar cochleaire pathologieën4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. De Whole-Mount cochleaire dissectie methode werd oorspronkelijk beschreven in een boek bewerkt door Hans Engstrom in 196616. Deze techniek werd vervolgens verfijnd en aangepast aan een verscheidenheid aan soorten zoals beschreven in de literatuur door een aantal wetenschappers in de hoorwetenschappen10,11,12,13, 15,17 en door de Eaton-Peabody Laboratories bij Massachusetts Eye en ear18. Onlangs werd een andere cochleaire dissectie-methode gerapporteerd door Montgomery et al.19. Micro dissectie van de slakkenhuis is een essentiële en kritieke stap voor cochleaire oppervlakte preparaten. Het ontleden van de muis cochleae is echter een technische uitdaging en vereist een aanzienlijke praktijk. Hier wordt een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode gepresenteerd voor gebruik in volwassen muis cochleae. Deze methode vereist de decalcificatie en het gebruik van cel-en weefsellijm (d.w.z. cel-tak) om de stukjes cochleair epitheel te hechten aan 10 mm ronde dekstroken voor immunolabeling. Cel en weefsellijm is op grote schaal gebruikt voor immunohistochemie20. Deze gemodificeerde cochleaire microdissection-methode is relatief eenvoudig in vergelijking met de eerder gerapporteerde18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cochleaire microdissectie van complete-Mount oppervlakte preparaten in combinatie met immunolabeling biedt een fundamenteel hulpmiddel voor onderzoek naar pathologieën van het binnenoor en moleculaire mechanismen. Deze gemodificeerde volwassen muis cochleaire dissectie methode met behulp van de cel en weefsellijm vereenvoudigt deze moeilijke procedure.
Hoewel deze aangepaste bereidingsmethode voor cochleaire oppervlakken relatief eenvoudig en toegankelijk is, is er nog steeds praktijk nodig o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het beschreven onderzoeksproject werd gesteund door Grant R01 DC009222 van het Nationaal Instituut voor doofheid en andere communicatiestoornissen, National Institutes of Health. Dit werk werd uitgevoerd in het WR-gebouw bij MUSC in een gerenoveerde ruimte ondersteund door Grant C06 RR014516. Dieren werden gehuisvest in MUSC CRI dier faciliteiten ondersteund door Grant C06 RR015455 van het Extramural Research facilities Program van het National Center for Research resources. De auteurs danken Dr. Jochen schacht voor zijn waardevolle commentaren en Andra Talaska voor het naleden van het manuscript.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
Referências
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
