Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus
Summary
Dieser Artikel stellt eine modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode vor, die eine Entkalkung und Verwendung eines Zell- und Gewebeklebers erfordert, um die Stücke der Cochlea-Epithel an 10 mm runden Abdeckungsscheinen für die Immunhistochemie bei erwachsenen Mauscochleae zu haften.
Abstract
Die auditive Verarbeitung in der Cochlea hängt von der Integrität der mechanosensorischen Haarzellen ab. Im Laufe eines Lebens kann Hörverlust aus zahlreichen Ätiologien wie der Exposition gegenüber übermäßigem Lärm, der Verwendung von ototoxischen Medikamenten, bakteriellen oder viralen Ohrinfektionen, Kopfverletzungen und dem Alterungsprozess erworben werden. Der Verlust sensorischer Haarzellen ist ein häufiges pathologisches Merkmal der Varianten des erworbenen Hörverlusts. Zusätzlich kann die innere Haarzellsynapse durch leichte Beleidigungen beschädigt werden. Daher sind Oberflächenpräparate von Cochlea-Epithelien in Kombination mit Immunetikettierungstechniken und konfokalen Bildern ein sehr nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Cochlea-Pathologien, einschließlich des Verlustes von Bandsynapsen und sensorischen Haarzellen, Veränderungen des Proteinspiegels in Haarzellen und unterstützenden Zellen, die Regeneration der Haarzellen und die Bestimmung der Berichtsgenexpression (d. h. GFP) zur Überprüfung der erfolgreichen Transduktion und Identifizierung von transduzierten Zelltypen. Die Cochlea, eine knöcherne spiralförmige Struktur im Innenohr, hält das auditive Sinnes-Endorgan, das Organ von Corti (OC). Sensorische Haarzellen und umgebende Stützzellen im OC sind im Cochlea-Kanal enthalten und ruhen auf der Basilarmembran, die tonotopisch mit hochfrequenter Detektion in der Basis und niederfrequenter Inderin im Scheitelpunkt organisiert ist. Mit der Verfügbarkeit molekularer und genetischer Informationen und der Fähigkeit, Gene durch Knockout- und Knock-in-Techniken zu manipulieren, wurden Mäuse in der biologischen Forschung weit verbreitet, auch in der Hörwissenschaft. Die erwachsene Mauscochlea ist jedoch winzig, und das Cochlea-Epithel ist in einem knöchernen Labyrinth eingekapselt, was die Mikrodissektion erschwert. Obwohl In vielen Laboratorien Seziertechniken entwickelt und eingesetzt wurden, ist diese modifizierte Mikrodissektionsmethode mit Zell- und Gewebeklebstoff einfacher und bequemer. Es kann in allen Arten von erwachsenen Maus Cochleae nach Entkalkung verwendet werden.
Introduction
Die Cochlea ist der Erkennung von Klang gewidmet und für das Hören verantwortlich. Der Cochlea-Kanal ist spiralförmig im knöchernen Labyrinth gewickelt und hält das auditive Sinnes-Endorgan, das Organ von Corti (OC). Das OC ruht auf der Basilarmembran, die das Cochlea-Epithel mit einer Länge von etwa 5,7 mm besteht, wenn es bei erwachsenen CBA/CaJ-Mäusen1,2abgewickelt wird. Da das OC tonotopisch mit hohen Frequenzen in der Basis und niedrigen Frequenzen in der Spitze detektiert ist, wird das Cochlea-Epithel oft in drei Teile für analytische Vergleiche unterteilt: die apikalen, mittleren und basalen Drehungen, die niedrigen, mittlere bzw. hochfrequente Erkennung. Zusätzlich zu einer Reihe von unterstützenden Zellen besteht das OC aus einer Reihe von inneren Haarzellen (IHCs), die sich medial befinden, und drei Reihen von äußeren Haarzellen (OHCs), die sich seitlich in Bezug auf die Cochlea-Spirale befinden.
Die korrekte auditive Verarbeitung hängt von der Integrität der sensorischen Haarzellen in der Cochlea ab. Die Schädigung oder der Verlust sensorischer Haarzellen ist ein häufiges pathologisches Merkmal erworbener Hörverluste, verursacht durch zahlreiche Ätiologien wie die Exposition gegenüber übermäßigem Lärm, die Verwendung von ototoxischen Medikamenten, bakterielle oder virale Ohrinfektionen, Kopfverletzungen und die Alterung Prozess3. Zusätzlich kann die Integrität und Funktion der inneren Haarzelle/Auditorennervensynapsen durch leichte Beleidigungen beeinträchtigt werden4. Mit der Verfügbarkeit molekularer und genetischer Informationen und der Manipulation von Genen durch Knockout- und Knock-in-Techniken sind Mäuse in der Hörwissenschaft weit verbreitet. Obwohl die adulte Mauscochlea winzig ist und das Cochlea-Epithel von einer knöchernen Kapsel umgeben ist, die zu technisch schwierigen Mikrodissektionen, Oberflächenpräparaten des Epithels in Kombination mit Immunlabeling oder Immunhistochemie führt. und konfokale Bilder wurden weit verbreitet für die Untersuchung von Cochlea-Pathologien verwendet, einschließlich Verluste von Bandsynapsen und Haarzellen, Veränderungen in der Menge an Proteinen in sensorischen Haarzellen und unterstützenden Zellen, und Haarzellenregeneration. Cochlea-Oberflächenpräparate wurden auch verwendet, um das Muster der Expression von Reportergenen (d. h. GFP) zu bestimmen und eine erfolgreiche Transduktion zu bestätigen und transduzierte Zelltypen zu identifizieren. Diese Techniken wurden zuvor für die Untersuchung molekularer Mechanismen verwendet, die einem lärminduzierten Hörverlust zugrunde liegen, mit erwachsenen CBA/J-Mäusen5,6,7,8,9.
Im Gegensatz zur Immunhistochemie mit Paraffinabschnitten oder Kryoschnitten, um kleine Querschnittsteile der Cochlea zu erhalten, die drei äußere Haarzellen (OHCs) und eine innere Haarzelle (IHC) auf jedem Abschnitt enthalten, ermöglichen Cochlea-Oberflächenpräparate Visualisierung der gesamten Länge des OC zum Zählen sensorischer Haarzellen und Bandsynapsen und Immunolabeling von sensorischen Haarzellen entsprechend bestimmten Funktionellen Frequenzen. Tabelle 1 zeigt die Kartierung von Hörfrequenzen als Funktion der Entfernung entlang der Länge der Cochlea-Spirale in erwachsenen CBA/J-Maus nach Studien von Müller1 und Viberg und Canlon1,2. Cochlea-Oberflächenpräparate wurden weit verbreitet für die Untersuchung von Cochlea-Pathologien4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Die ganzmontierte Cochlea-Sektionsmethode wurde ursprünglich in einem Buch beschrieben, das 1966 von Hans Engstrom herausgegeben wurde16. Diese Technik wurde anschließend verfeinert und an eine Vielzahl von Arten angepasst, wie in der Literatur von einer Reihe von Wissenschaftlern in der Hörwissenschaftbeschrieben 10,11,12,13, 15,17 und von den Eaton-Peabody Laboratories at Massachusetts Eye and Ear18. Kürzlich wurde eine weitere Cochlea-Sektionsmethode von Montgomery et al.19berichtet. Die Mikrodissektion der Cochlea ist ein wesentlicher und kritischer Schritt für Cochlea-Oberflächenpräparate. Die Sezieren von Mauscochleae ist jedoch eine technische Herausforderung und erfordert umfangreiche Übung. Hier wird ein modifiziertes Cochlea-Oberflächenpräparat zur Verwendung bei erwachsenen Mauscochleae vorgestellt. Diese Methode erfordert eine Entkalkung und Verwendung von Zell- und Gewebeklebstoff (d. h. Cell-Tak), um die Stücke des Cochlea-Epithels an 10 mm runden Abdeckungen für die Immunkennzeichnung zu kleben. Zell- und Gewebeklebstoff wurde weit verbreitet für die Immunhistochemieverwendet 20. Diese modifizierte Cochlea-Mikrodissektionsmethode ist relativ einfach im Vergleich zu denen zuvor berichtet18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Cochlea-Mikrodissektion von Flächenpräparaten mit ganzer Montage in Kombination mit Derimmunolabeling stellt ein grundlegendes Werkzeug zur Untersuchung von Innenohrpathologien und molekularen Mechanismen bereit. Diese modifizierte Cochlea-Sektionsmethode für Erwachsene mit zell- und Gewebeklebstoff vereinfacht dieses schwierige Verfahren.
Obwohl diese modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode relativ einfach und zugänglich ist, erfordert sie dennoch Praxis, um Fähigkeiten…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das beschriebene Forschungsprojekt wurde durch das Stipendium R01 DC009222 vom National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health, unterstützt. Diese Arbeiten wurden im WR-Gebäude des MUSC in renoviertem Raum durchgeführt, der durch den Zuschuss C06 RR014516 unterstützt wurde. Die Tiere wurden in MUSC CRI-Tiereinrichtungen untergebracht, die durch das Stipendium C06 RR015455 aus dem Extramural Research Facilities Program des National Center for Research Resources unterstützt wurden. Die Autoren danken Dr. Jochen Schacht für seine wertvollen Kommentare und Andra Talaska für das Korrekturlesen des Manuskripts.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
Referências
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