Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto
Summary
Este artículo presenta un método de preparación de superficie coclear modificado que requiere descalcificación y uso de un adhesivo celular y tisular para adherir las piezas de epitelía coclear a 10 mm de resbalones de cubierta redonda para inmunohistoquímica en cocleares de ratón adultos.
Abstract
El procesamiento auditivo en la cócleara depende de la integridad de las células pilosas mecanosensoriales. A lo largo de toda la vida, la pérdida auditiva se puede obtener de numerosas etiologías, como la exposición al ruido excesivo, el uso de medicamentos ototóxicos, infecciones bacterianas o virales del oído, lesiones en la cabeza y el proceso de envejecimiento. La pérdida de células pilosas sensoriales es una característica patológica común de las variedades de pérdida auditiva adquirida. Además, la sinapsis de la célula del cabello interno puede ser dañada por leves insultos. Por lo tanto, las preparaciones superficiales de la epitelía coclear, en combinación con técnicas de inmunoetiquetado e imágenes confocales, son una herramienta muy útil para la investigación de patologías cocleares, incluyendo pérdidas de sinapsis de cinta y células pilosas sensoriales, cambios en los niveles de proteínas en las células pilosas y células de apoyo, regeneración de células pilosas y determinación de la expresión génica del informe (es decir, GFP) para la verificación de la transducción exitosa y la identificación de tipos de células transducidas. La cócleara, una estructura ósea en forma de espiral en el oído interno, sostiene el órgano final sensorial auditivo, el órgano de Corti (OC). Las células pilosas sensoriales y las células de soporte circundantes en la OC están contenidas en el conducto coclear y descansan sobre la membrana basilar, organizadas de manera tonotópica con detección de alta frecuencia que se produce en la base y baja frecuencia en el ápice. Con la disponibilidad de información molecular y genética y la capacidad de manipular genes mediante técnicas de nocaut y knock-in, los ratones han sido ampliamente utilizados en la investigación biológica, incluso en la ciencia auditiva. Sin embargo, la cócleara de ratón adulta es minúscula, y el epitelio coclear está encapsulado en un laberinto óseo, lo que dificulta la microdisección. Aunque las técnicas de disección se han desarrollado y utilizado en muchos laboratorios, este método de microdisección modificada utilizando adhesivo celular y tisular es más fácil y más conveniente. Se puede utilizar en todo tipo de cocleares de ratón adultos después de la descalcificación.
Introduction
La cócleara se dedica a la detección de sonido y responsable de la audición. El conducto coclear se enrolla en forma de espiral en el laberinto óseo y sostiene el órgano final sensorial auditivo, el órgano de Corti (OC). El OC descansa sobre la membrana basilar, que compone el epitelio coclear, con una longitud de unos 5,7 mm cuando se desenrolla en ratones ADULTOs CBA/CaJ1,2. Debido a que el OC está organizado tonotópicamente con altas frecuencias detectadas en la base y frecuencias bajas en el ápice, el epitelio coclear a menudo se divide en tres partes para comparaciones analíticas: los giros apicales, medios y basales correspondientes a bajos, detección de frecuencia media y alta, respectivamente. Además de una serie de células de apoyo, la OC se compone de una fila de células pilosas internas (IHC) ubicadas medialmente y tres filas de células del cabello exteriores (OHC) ubicadas lateralmente con respecto a la espiral coclear.
El procesamiento auditivo correcto depende de la integridad de las células pilosas sensoriales en la cócleara. El daño o la pérdida de células pilosas sensoriales es una característica patológica común de la pérdida auditiva adquirida, causada por numerosas etiologías como la exposición al ruido excesivo, el uso de medicamentos ototóxicos, infecciones bacterianas o virales del oído, lesiones en la cabeza y el envejecimiento proceso3. Además, la integridad y la función de las sinapsis de la célula capilar interna/nervio auditivo pueden verse afectadas por leves insultos4. Con la disponibilidad de información molecular y genética y la manipulación de genes por técnicas de nocaut y knock-in, los ratones han sido ampliamente utilizados en la ciencia auditiva. Aunque la cócleara de ratón adulta es minúscula y el epitelio coclear está rodeado por una cápsula ósea que resulta en microdisecciones técnicamente difíciles, preparaciones superficiales del epitelio en combinación con inmunoetiquetado o inmunohistoquímica y las imágenes confocales se han utilizado ampliamente para la investigación de patologías cocleares, incluyendo pérdidas de sinapsis de cinta y células pilosas, cambios en los niveles de proteínas en las células pilosas sensoriales y células de apoyo, y la regeneración de células pilosas. También se han utilizado preparaciones de superficie coclear para determinar el patrón de expresión de los genes reporteros (es decir, GFP) y confirmar la transducción exitosa e identificar tipos de células transducidas. Estas técnicas se han utilizado previamente para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a la pérdida auditiva inducida por ruido utilizando ratones CBA/J adultos5,6,7,8,9.
A diferencia de la inmunohistoquímica usando secciones de parafina o criosecciones para obtener pequeñas porciones transversales de la cócleara que contienen tres células del cabello exteriores (OHC) y una célula del cabello interno (IHC) en cada sección, las preparaciones de la superficie coclear permiten visualización de toda la longitud del OC para el recuento de células pilosas sensoriales y sinapsis de cinta e inmunoetiquetado de células pilosas sensoriales correspondientes a frecuencias funcionales específicas. La Tabla 1 muestra el mapeo de frecuencias auditivas en función de la distancia a lo largo de la longitud de la espiral coclear en el ratón adulto CBA/J según estudios de Muller1 y Viberg y Canlon1,2. Preparaciones de superficie coclear han sido ampliamente utilizados para la investigación de patologías cocleares4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. El método de disección coclear de montaje completo fue descrito originalmente en un libro editado por Hans Engstrom en 196616. Esta técnica fue posteriormente refinada y adaptada a una variedad de especies como se describe en la literatura por un número de científicos en ciencias auditivas10,11,12,13, 15,17 y por los Laboratorios Eaton-Peabody en Massachusetts Eye and Ear18. Recientemente, Montgomery et al.19informó otro método de disección coclear. La microdisección de la cócleara es un paso esencial y crítico para las preparaciones de superficie coclear. Sin embargo, la diseción de las cocleares de ratón es un desafío técnico y requiere una práctica considerable. Aquí, se presenta un método de preparación de superficie coclear modificado para su uso en cócleares de ratón adultos. Este método requiere la descalcificación y el uso de adhesivo celular y tisular (es decir, Cell-Tak) para adherir las piezas de epitelio coclear a 10 mm de cubres redondos para inmunoetiquetado. Adhesivo celular y tisular ha sido ampliamente utilizado para la inmunohistoquímica20. Este método de microdisección coclear modificado es relativamente simple en comparación con los reportados anteriormente18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microdisección coclear de preparaciones de superficie de montaje completo en combinación con el inmunoetiquetado proporciona una herramienta básica para la investigación de patologías del oído interno y mecanismos moleculares. Este método de disección coclear de ratón adulto modificado utilizando el adhesivo celular y tisular simplifica este difícil procedimiento.
Aunque este método de preparación de superficie coclear modificado es relativamente fácil y accesible, todavía req…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto de investigación descrito fue apoyado por la subvención R01 DC009222 del Instituto Nacional de Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo se llevó a cabo en el edificio WR de MUSC en un espacio renovado apoyado por la subvención C06 RR014516. Los animales fueron alojados en instalaciones animales MUSC CRI apoyados por la subvención C06 RR015455 del Programa de Instalaciones de Investigación Extramuros del Centro Nacional de Recursos de Investigación. Los autores agradecen al Dr. Jochen Schacht por sus valiosos comentarios y a Andra Talaska por la corrección del manuscrito.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
Referências
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