Cochlears ytbehandling i den vuxna musen
Summary
Denna artikel presenterar en modifierad Cochlear ytbehandling metod som kräver urkalkning och användning av en cell och vävnad lim för att fästa bitar av Cochlear epitel till 10 mm runda täcker glider för immunohistokemi i Adult Mouse cochleae.
Abstract
Hörsel behandling i hörselsnäckan beror på integriteten hos de mechanosensoriska hårcellerna. Under en livstid, hörselnedsättning kan förvärvas från många etiologier såsom exponering för överdriven buller, användning av ototoxiska mediciner, bakteriella eller virala öroninfektioner, huvudskador, och åldrandet. Förlust av sensoriska hårceller är ett vanligt patologiskt inslag i de sorter av förvärvad hörselnedsättning. Dessutom kan den inre hår cells synapsen skadas av milda förolämpningar. Därför är ytbehandling av Cochlear epithelia, i kombination med immunolabeling tekniker och konfokala bilder, ett mycket användbart verktyg för utredning av Cochlear patologier, inklusive förluster av band synapser och sensoriska hårceller, förändringar i proteinnivåer i hårceller och stödjande celler, hår cellförnyelse, och bestämning av rapport genuttryck (dvs., GFP) för verifiering av framgångsrik transduktion och identifiering av sensorik celltyper. Hörselsnäckan, en benig Spiral-formad struktur i innerörat, håller auditiva sensoriska änden orgel, organ Corti (OC). Sensoriska hårceller och omgivande stödjande celler i OC finns i cochleaimplantat och vila på basilaris membran, organiserade i en tonotopic mode med högfrekvent detektion som sker i basen och lågfrekventa i spetsen. Med tillgången till molekylär och genetisk information och förmågan att manipulera gener genom knockout-och Knock-in-tekniker har möss ofta använts i biologisk forskning, bland annat i hörselvetenskap. Men den vuxna musen snäckan är miniscule, och Cochlear epitel är inkapslad i en benig labyrint, vilket gör microdissection svårt. Även dissektion tekniker har utvecklats och används i många laboratorier, denna modifierade microdissection metod med hjälp av cell-och vävnadslim är lättare och bekvämare. Det kan användas i alla typer av vuxna mus cochleae efter decalcification.
Introduction
Snäckan är tillägnad detektering av ljud och ansvarig för hörsel. Cochleaimplantat är lindad i en spiralform i beniga labyrinten och håller den auditiva sensoriska änden orgel, organ Corti (OC). OC vilar på basilaris membran, vilket gör upp Cochlear epitel, med en längd av ca 5,7 mm när utrullas i vuxen CBA/Caj möss1,2. Eftersom OC är tonotopically organiseras med höga frekvenser upptäcks i basen och låga frekvenser i spetsen, är cochleaimepitel ofta uppdelad i tre delar för analytiska jämförelser: den apikala, mellersta och basala svängar som motsvarar låg, respektive hög frekvens detektering. Förutom en rad stödjande celler, är OC består av en rad av inre hårceller (IHCs) ligger medialt och tre rader av yttre hårceller (OHCs) ligger i sidled med avseende på Cochlear spiral.
Korrekt hörsel behandling beror på integriteten hos de sensoriska hårcellerna i hörselsnäckan. Skador eller förlust av sensoriska hårceller är ett vanligt patologiskt inslag i förvärvade hörselnedsättning, orsakas av många etiologier såsom exponering för överdriven buller, användning av ototoxiska mediciner, bakteriella eller virala öroninfektioner, huvudskador, och åldrande process3. Dessutom kan integriteten och funktionen hos den inre hår cellen/hörselnerven synapser försämras av milda förolämpningar4. Med tillgången till molekylär och genetisk information och manipulering av gener genom knockout-och Knock-in-tekniker har möss ofta använts i hörsel vetenskapen. Även om den vuxna musen snäckan är mycket liten och Cochlear epitel är omgiven av en benig kapsel som resulterar i tekniskt svåra mikrodissektioner, ytpreparationer av epitelet i kombination med immunolabeling eller immunohistokemi och konfokala bilder har i stor utsträckning använts för utredning av Cochlears patologier, inklusive förluster av band synapser och hårceller, förändringar i nivåer av proteiner i sensoriska hårceller och stödjande celler, och hår cellförnyelse. Cochlear Surface-preparat har också använts för att bestämma mönstret för uttryck av rapportörer (dvs. GFP) och bekräfta lyckad transduktion och identifiera celltyper som är omvandade till celler. Dessa tekniker har tidigare använts för studiet av molekylära mekanismer bakom bullerinducerad hörselnedsättning med hjälp av vuxna CBA/J möss5,6,7,8,9.
Till skillnad från immunohistokemi med hjälp av paraffin sektioner eller kryosektioner att få små tvärsnitts delar av hörselsnäckan som innehåller tre yttre hårceller (OHCs) och en inre hårcell (IHC) på varje sektion, Cochlear Surface preparat tillåter visualisering av hela längden av OC för att räkna sensoriska hårceller och band synapser och immunolabeling av sensoriska hårceller som motsvarar specifika funktionella frekvenser. Tabell 1 visar kartläggningen av hörsel frekvenser som en funktion av avståndet längs Cochlears spiral i vuxen CBA/J-mus enligt studier från Muller1 och Viberg och Canlon1,2. Cochlear ytbehandling har använts i stor utsträckning för undersökning av Cochlear-patologier4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Den hela-Mount Cochlear dissektion metoden beskrevs ursprungligen i en bok redigerad av hans Engström i 196616. Denna teknik har därefter förfinats och anpassats till en rad olika arter som beskrivs i litteraturen av ett antal forskare inom hörselvetenskap10,11,12,13, 15,17 och av Eaton-Peabody Laboratories i Massachusetts Eye och Ear18. Nyligen rapporterades en annan Cochlear dissekeringsmetod av Montgomery et al.19. Microdissektion av snäckan är ett viktigt och kritiskt steg för cochleaimplantat. Emellertid, dissekera mus cochleae är en teknisk utmaning och kräver betydande praxis. Här presenteras en modifierad Cochlear Surface-prepareringsmetod för användning i Adult Mouse cochleae. Denna metod kräver urkalkning och användning av cell-och vävnadslim (dvs cell-tak) att fästa bitar av cochlea epitel till 10 mm runda täckband för immunolabeling. Cell-och vävnadslim har använts i stor utsträckning för immunohistokemi20. Denna modifierade Cochlear microdissekeringsmetod är relativt enkel jämfört med de som tidigare rapporterades18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cochlear microdissection av helmonterade ytpreparat i kombination med immunolabeling ger ett grundläggande verktyg för utredning av innerörat patologier och molekylära mekanismer. Denna modifierade vuxna mus Cochlear dissektion metod med hjälp av cell-och vävnadslim förenklar detta svåra förfarande.
Även om denna modifierade Cochlears ytbehandlingsmetod är relativt enkel och tillgänglig, krävs fortfarande övning för att uppnå färdighet. För att göra de rätta nedskärningarn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningsprojektet som beskrevs stöddes av Grant R01 DC009222 från det nationella institutet för dövhet och andra kommunikationsstörningar, National Institutes of Health. Detta arbete genomfördes i WR byggnaden på MUSC i renoverade rymden stöds av Grant C06 RR014516. Djur var inrymt i MUSC CRI djurfaciliteter som stöds av Grant C06 RR015455 från Extramural forskning anläggningar program för National Center for Research Resources. Författarna tackar Dr Jochen Schacht för hans värdefulla kommentarer och andra Talaska för korrekturläsning av manuskriptet.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
Referências
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
