Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama
Summary
Bu makalede, yetişkin fare kokleae immünohistokimya için 10 mm yuvarlak kapak fişleri koklear epitel parçaları yapıştırmak için bir hücre ve doku yapıştırıcı kullanımı ve kireçlenme gerektiren değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunar.
Abstract
Kokleada işitsel işleme mekanosensory saç hücrelerinin bütünlüğüne bağlıdır. Bir ömür boyunca, işitme kaybı aşırı gürültüye maruz kalma gibi çok sayıda etiyolojisi elde edilebilir, ototoksik ilaçların kullanımı, bakteriyel veya viral kulak enfeksiyonları, kafa yaralanmaları, ve yaşlanma süreci. Duyusal saç hücrelerinin kaybı edinilmiş işitme kaybı çeşitlerinin ortak bir patolojik özelliğidir. Ayrıca, iç saç hücre sinaps hafif hakaretler tarafından zarar görebilir. Bu nedenle, koklear epitelin yüzey preparatları, immünetiketleme teknikleri ve konfokal görüntülerle birlikte, şerit sinapsları ve duyusal saç hücrelerinin kayıpları da dahil olmak üzere koklear patolojilerin araştırılması nda çok yararlı bir araçtır, saç hücrelerinde ve destekleyici hücrelerde protein düzeylerinde değişiklikler, saç hücresi yenilenmesi, ve rapor gen ekspresyonunun belirlenmesi (yani, GFP) başarılı transdüksiyon doğrulama ve transdükse hücre tiplerinin belirlenmesi için. Koklea, iç kulakta kemikli spiral şekilli bir yapı, işitsel duyu salkım organı tutar, Corti organı (OC). Duyusal saç hücreleri ve OC çevreleyen destek hücreleri koklear kanal ve basiler membran üzerinde dinlenme, baz ve apeks düşük frekanslı meydana gelen yüksek frekanslı algılama ile tonotopik bir şekilde düzenlenen bulunur. Moleküler ve genetik bilginin kullanılabilirliği ve nakavt ve nakavt teknikleri ile genleri manipüle etme yeteneği ile, fareler yaygın işitme bilimi de dahil olmak üzere biyolojik araştırmalarda kullanılmıştır. Ancak, yetişkin fare koklea miniscule, ve koklear epitel kemikli bir labirent içinde kapsüllenmiş, mikrodisesit zor hale. Diseksiyon teknikleri birçok laboratuvarda geliştirilmiş ve kullanılmış olsa da, hücre ve doku yapıştırıcısı kullanan bu modifiye mikrodisesiyöntemi daha kolay ve kullanışlıdır. Kireçlenmeden sonra her türlü yetişkin fare kokleasında kullanılabilir.
Introduction
Koklea ses in algılanmasına adanmıştır ve işitmeden sorumludur. Koklear kanal kemik labirent bir spiral şeklinde sarılır ve işitsel duyusal son organ tutar, Corti organı (OC). OC baziler membran üzerinde, koklear epitel oluşturan, yaklaşık bir uzunluğu ile 5.7 mm yetişkin CBA / CaJ fareler de uncoiled1,2. OC tonotopik baz ve apeks düşük frekanslarda tespit yüksek frekansları ile organize olduğundan, koklear epitel genellikle analitik karşılaştırmalar için üç bölüme ayrılır: apikal, orta ve bazal düşük karşılık gelen döner, orta ve yüksek frekans algılama, sırasıyla. Destekleyen hücreler dizisine ek olarak, OC, medial olarak bulunan bir iç saç hücresi (IHC) sırası ve koklear spirale göre yanal olarak bulunan üç sıra dış saç hücrelerinden (OhC) oluşur.
Doğru işitsel işleme koklea duyusal saç hücrelerinin bütünlüğüne bağlıdır. Duyusal saç hücrelerinin hasar veya kaybı, aşırı gürültüye maruz kalma, ototoksik ilaçların kullanımı, bakteriyel veya viral kulak enfeksiyonları, kafa yaralanmaları ve yaşlanma gibi çok sayıda etiyolojisi neden olduğu kazanılmış işitme kaybı, ortak bir patolojik özelliğidir süreç3. Ayrıca, bütünlük ve iç saç hücresi fonksiyonu / işitsel sinir sinapsları hafif hakaret ler tarafından bozulabilir4. Moleküler ve genetik bilginin mevcudiyeti ve genlerin nakavt ve nakavt teknikleri ile manipüle edilebisi ile, fareler işitme biliminde yaygın olarak kullanılmaktadır. Yetişkin fare koklea küçük ve koklear epitel teknik olarak zor mikrodiskes ile sonuçlanan kemikli bir kapsül ile çevrili olmasına rağmen, immünetiketleme veya immünohistokimya ile birlikte epitel yüzey preparatları ve konfokal görüntüler geniş kollear patolojilerin araştırılması için kullanılmıştır, şerit sinaps ve saç hücrelerinin kayıpları da dahil olmak üzere, duyusal saç hücrelerinde protein düzeylerinde değişiklikler ve destekleyici hücreler, ve saç hücresi rejenerasyonu. Koklear yüzey preparatları da muhabir genlerin ekspresyon deseni belirlemek için kullanılmıştır (yani, GFP) ve başarılı transdüksiyon onaylamak ve transdükse hücre tiplerini belirlemek. Bu teknikler daha önce yetişkin CBA / J fareler5,6,7,8,9kullanarak gürültü kaynaklı işitme kaybı altında yatan moleküler mekanizmaların çalışması için kullanılmıştır.
Her bölümde üç dış saç hücresi (OHC) ve bir iç saç hücresi (IHC) içeren kokleanın küçük kesitkısımlarını elde etmek için parafin kesitleri veya kriyokesitler kullanarak immünohistokimyanın aksine, koklear yüzey preparatları duyusal saç hücreleri ve şerit sinapsları sayma ve duyusal saç hücrelerinin belirli fonksiyonel frekanslara karşılık gelen immünetiketleme için OC tüm uzunluğu görselleştirme. Tablo 1 Muller1 ve Viberg ve Canlon1,2çalışmalara göre yetişkin CBA / J fare koklear spiral uzunluğu boyunca mesafe bir fonksiyonu olarak işitme frekansları haritalama gösterir . Koklear yüzey preparatları koklear patolojilerin araştırılmasında yaygın olarak kullanılmıştır4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Tüm montaj koklear diseksiyon yöntemi aslında hans Engstrom tarafından 196616yılında düzenlenmiş bir kitapta tanımlanmıştır. Bu teknik daha sonra rafine edilmiş ve işitme bilimi bilim adamları bir dizi tarafından literatürde açıklandığı gibi türlerin çeşitli adapte10,11,12,13, 15,17 ve Eaton-Peabody Laboratuvarları tarafından Massachusetts Göz ve Kulak18. Son zamanlarda, başka bir koklear diseksiyon yöntemi Montgomery ve ark.19tarafından bildirilmiştir. Kokleanın mikrodiseksiyonu koklear yüzey preparatları için önemli ve kritik bir adımdır. Ancak, fare kokleae diseksiyon teknik bir sorundur ve önemli bir uygulama gerektirir. Burada, yetişkin fare kokleae kullanılmak üzere değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunulmaktadır. Bu yöntem, kochlear epitel parçalarını immünetiketleme için 10 mm yuvarlak kapaklara yapıştırmak için hücre ve doku yapıştırıcısının (yani Cell-Tak) kireçlenmeyi ve kullanımını gerektirir. Hücre ve doku yapıştırıcıyaygın immünohistokimya20için kullanılmaktadır. Bu modifiye koklear mikrodisesiksiyon yöntemi daha önce bildirilen18göre nispeten basittir18 ,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immünetiketleme ile birlikte tam montaj yüzey preparatlarının koklear mikrodizise, iç kulak patolojileri ve moleküler mekanizmaların araştırılması için temel bir araç tır. Bu modifiye yetişkin fare koklear diseksiyon yöntemi hücre ve doku yapıştırıcı kullanarak bu zor prosedürü basitleştirir.
Bu modifiye koklear yüzey hazırlama yöntemi nispeten kolay ve erişilebilir olmasına rağmen, yine de yeterlilik elde etmek için uygulama gerektirir. Doğru kesimyapmak için…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Açıklanan araştırma projesi, Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden Hibe R01 DC009222 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Hibe C06 RR014516 tarafından desteklenen yenilenmiş alanda MUSC’deki WR Binası’nda gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar, Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi’nin Ekstramural Araştırma Tesisleri Programı’ndan C06 RR015455 hibe ile desteklenen MUSC CRI hayvan tesislerinde barındı. Yazarlar değerli yorumları için Dr. Jochen Schacht’a ve el yazmasının okunması için Andra Talaska’ya teşekkür eder.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
Referências
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
