Schnelle Herstellung von kundenspezifischen mikrofluidischen Geräten für Forschungs- und Bildungsanwendungen
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Konstruktion und Herstellung von kundenspezifischen mikrofluidischen Geräten mit minimalen finanziellen und zeitlichen Investitionen. Ziel ist es, die Einführung mikrofluidischer Technologien in biomedizinischen Forschungslaboratorien und Bildungseinrichtungen zu erleichtern.
Abstract
Mikrofluidische Geräte ermöglichen die Manipulation von Flüssigkeiten, Partikeln, Zellen, mikrogroßen Organen oder Organismen in Kanälen von Nano- bis Submillimeter-Skalen. Eine rasche Zunahme des Einsatzes dieser Technologie in den biologischen Wissenschaften hat zu einem Bedarf an Methoden geführt, die für eine Vielzahl von Forschungsgruppen zugänglich sind. Aktuelle Fertigungsstandards, wie z. B. PDMS-Bindung, erfordern teure und zeitaufwändige Lithographien- und Klebetechniken. Eine praktikable Alternative ist die Verwendung von Geräten und Materialien, die leicht erschwinglich sind, minimales Know-how erfordern und eine schnelle Iteration von Designs ermöglichen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Entwicklung und Herstellung von PET-Laminaten (PETLs), mikrofluidischen Geräten, die kostengünstig, einfach herzustellen sind und deutlich weniger Zeit für die Erzeugung als andere Ansätze zur Mikrofluidiktechnologie verbrauchen. Sie bestehen aus thermisch verklebten Folienblechen, in denen Kanäle und andere Merkmale mit einem Handwerksschneider definiert werden. PETLs lösen feldspezifische technische Herausforderungen und verringern gleichzeitig Hindernisse für die Einführung drastisch. Dieser Ansatz erleichtert den Zugang zu mikrofluidischen Geräten sowohl in der Forschung als auch im Bildungsbereich und bietet eine zuverlässige Plattform für neue Untersuchungsmethoden.
Introduction
Mikrofluidik ermöglicht Flüssigkeitskontrolle in kleinen Maßstäben, mit Volumina von Mikrolitern (1 x 10-6 L) bis zu Pikolitern (1 x 10-12 L). Diese Kontrolle wurde zum Teil durch die Anwendung von Mikrofertigungstechniken ermöglicht, die der Mikroprozessorindustrie1entlehnt wurden. Die Verwendung von mikrogroßen Kanälen und Kammern ermöglicht es dem Anwender, die unterschiedlichen physikalischen Phänomene zu nutzen, die für kleine Dimensionen charakteristisch sind. Beispielsweise können Flüssigkeiten auf der Mikrometerskala mit laminarem Fluss manipuliert werden, bei dem viskose Kräfte Trägheitskräfte dominieren. Dadurch wird der diffusive Transport zum herausragenden Merkmal der Mikrofluidik und kann quantitativ und experimentell untersucht werden. Diese Systeme können richtig verstanden werden, indem man Gesetze, die Brownsche Bewegungstheorie, die Wärmegleichung und/oder die Navier-Stokes-Gleichungen verwendet, die wichtige Ableitungen in den Bereichen Strömungsmechanik und Transportphänomene sind2.
Da viele Gruppen in den Biowissenschaften komplexe Systeme auf mikroskopischer Ebene untersuchen, wurde ursprünglich angenommen, dass mikrofluidische Geräte einen unmittelbaren und signifikanten Einfluss auf Forschungsanwendungen in der Biologie2,3haben würden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Diffusion beim Transport kleiner Moleküle über Membranen oder innerhalb einer Zelle dominant ist und die Abmessungen von Zellen und Mikroorganismen ideal für Submillimetersysteme und -geräte passen. Daher gab es ein erhebliches Potenzial für die Verbesserung der Art und Weise, wie zelluläre und molekulare Experimente durchgeführt werden. Die breite Einführung mikrofluidischer Technologien durch Biologen blieb jedoch hinter den Erwartungen zurück4. Ein einfacher Grund für den mangelnden Technologietransfer könnten die disziplinären Grenzen sein, die Ingenieure und Biologen trennen. Das Design und die Fertigung von kundenspezifischen Geräten sind außerhalb der Möglichkeiten der meisten biologischen Forschungsgruppen geblieben, so dass sie von externem Know-how und Einrichtungen abhängig sind. Mangelnde Vertrautheit mit potenziellen Anwendungen, Kosten und die Zeit, die für die Entwurfsiteration benötigt wird, sind ebenfalls erhebliche Hindernisse für neue Anwender. Es ist wahrscheinlich, dass diese Barrieren dazu beideraige Innovationen haben und die weit verbreitete Anwendung von Mikrofluidik verhindern, um Herausforderungen in den biologischen Wissenschaften anzugehen.
Ein Beispiel: Seit Ende der 1990er Jahre ist die Soft-Photolithographie die Methode der Wahl für die Herstellung von mikrofluidischen Geräten. PDMS (Polydimethylsiloxan, ein organisches Polymer auf Silikonbasis) ist ein weit verbreitetes Material aufgrund seiner physikalischen Eigenschaften, wie Transparenz, Verformbarkeit und Biokompatibilität5. Die Technik hat großen Erfolg, mit Lab-on-a-Chip und Organ-on-a-Chip-Geräte kontinuierlich auf dieser Plattform entwickelt6. Die meisten Gruppen, die an diesen Technologien arbeiten, sind jedoch in Ingenieurabteilungen zu finden oder haben starke Verbindungen zu ihnen4. Die Lithographie erfordert in der Regel Reinräume für die Herstellung von Formen und speziellen Verklebungsgeräten. Für viele Gruppen macht dies Standard-PDMS-Geräte aufgrund ihrer Kapitalkosten und Vorlaufzeiten weniger ideal, insbesondere wenn wiederholte Konstruktionsänderungen vorgenommen werden müssen. Darüber hinaus ist die Technologie für den durchschnittlichen Biologen und Studenten ohne Zugang zu spezialisierten Ingenieurlabors meist unzugänglich. Es wurde vorgeschlagen, dass mikrofluidische Geräte, damit sie weit verbreitet sind, einige der Qualitäten von Materialien nachahmen müssen, die häufig von Biologen verwendet werden. Beispielsweise ist Polystyrol, das für die Zellkultur und Bioassays verwendet wird, kostengünstig, Einweg und für die Massenproduktion geeignet. Im Gegensatz dazu wurde die industrielle Herstellung von PDMS-basierten Mikrofluidik enden nie aufgrund seiner mechanischen Weichheit, Oberflächenbehandlung Instabilität, und Gasdurchlässigkeit5realisiert. Aufgrund dieser Einschränkungen und mit dem Ziel, technische Herausforderungen mit kundenspezifischen Geräten zu lösen, die “in-house” gebaut wurden, beschreiben wir eine alternative Methode, die xurography7,8,9 Protokolle und thermische Laminierung verwendet. Diese Methode kann mit wenig Kapital und Zeitinvestitionen angenommen werden.
PETLs werden aus Polyethylenterephthalat (PET)-Folie hergestellt, die mit dem thermoklebenden Ethylen-Vinylacetat (EVA) beschichtet ist. Beide Materialien sind weit verbreitet in Konsumgütern verwendet, sind biokompatibel und sind leicht verfügbar zu minimalen Kosten10. PET/EVA-Folie kann in Form von Laminierbeuteln oder Rollen erhalten werden. Mit einem computergesteuerten Handwerksschneider, der häufig in Hobby- oder Handwerksläden zu finden ist, werden Kanäle aus einem einzigen Folienblatt herausgeschnitten, um die Architektur des Geräts zu definieren11. Die Kanäle werden dann durch auftragende zusätzliche Folien- (oder Glas-)Schichten versiegelt, die mit einem (Büro-)Thermolaminator verklebt werden (Abbildung 1A). Perforierte, selbstklebende Vinylstoßfänger werden hinzugefügt, um den Zugang zu den Kanälen zu erleichtern. Die Fertigungszeiten liegen zwischen 5 und 15 min, was eine schnelle Designiteration ermöglicht. Alle Geräte und Materialien, die zur Herstellung von PETLs verwendet werden, sind kommerziell zugänglich und erschwinglich (<350 USD Startkosten, verglichen mit Tausenden von USDs für Lithographie). Daher bieten PETLs eine neuartige Lösung für zwei Hauptprobleme konventioneller Mikrofluidik: Erschwinglichkeit und Zeitwirksamkeit (siehe PDMS/PETL-Vergleich in den ergänzenden Tabellen 1, 2).
Zusätzlich zu den Möglichkeiten für Forscher, ihre eigenen Geräte zu entwerfen und herzustellen, können PETLs einfach im Klassenzimmer übernommen werden, da sie einfach und intuitiv zu bedienen sind. PETLs können in die Lehrpläne8der High School und College aufgenommen werden, wo sie den Schülern helfen, physikalische, chemische und biologische Konzepte wie Diffusion, Laminarfluss, Mikromischung, Nanopartikelsynthese, Gradientenbildung und Chemotaxis besser zu verstehen.
In dieser Arbeit veranschaulichen wir den gesamten Workflow für die Herstellung von Modell-PETLs-Chips mit unterschiedlicher Komplexität. Das erste Gerät wird verwendet, um die Bildgebung von Zellen und Mikroorganen in einer kleinen Kammer zu erleichtern. Das zweite, komplexere Gerät besteht aus mehreren Schichten und Materialien und wird für die Forschung in der Mechanobiologie9verwendet. Schließlich haben wir ein Gerät entwickelt, das verschiedene Strömungsdynamikkonzepte (hydrodynamische Fokussierung, laminareströmung, diffusiven Transport und Mikromix) für pädagogische Zwecke anzeigt. Die hier vorgestellten Workflow- und Gerätedesigns lassen sich sowohl im Forschungs- als auch im Klassenzimmer einfach auf eine Vielzahl von Zwecken anpassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während Mikrofluidik zunehmend in der Werkzeugkiste von Laboratorien auf der ganzen Welt vorhanden ist, war das Tempo der Annahme enttäuschend, angesichts des Potenzials für seine positive Wirkung16. Niedrige Kosten und hohe Effizienz der Herstellung mikrofluidischer Geräte sind unerlässlich, um die Einführung dieser Technologie im durchschnittlichen Forschungslabor zu beschleunigen. Die hier beschriebene Methode verwendet mehrere Folienschichten, um zwei- und dreidimensionale Geräte zu ein…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit in diesem Manuskript wurde teilweise von der National Science Foundation (NSF) (Grant No. CBET-1553826) (und die dazugehörige ROA-Ergänzung) und die National Institutes of Health (NIH) (Grant-Nr. R35GM124935) an J.Z., und der Notre Dame Melchor Visiting Faculty Fund to F.O. Wir danken Jenna Sjoerdsma und Basar Bilgiéer für die Bereitstellung von Säugetierzellen und Kulturprotokollen sowie Fabio Sacco für die Unterstützung bei zusätzlichen Zahlen.
Materials
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 – 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film – Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
Referências
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