JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

תא עיתונאי מקרופאג שיטה לבחון קולטן שיחת כמו-תיווך NF-kB/AP-1 איתות על שכבות חלבון Adsorbed על משטחים פולימריים

Published: January 07, 2020
doi:
10.3791/60317
, ,
1Department of Chemical Engineering,Queen’s University

Summary

פרוטוקול זה מספק לחוקרים עם שיטה מהירה, עקיפה של מדידת tlr תלויי-NF-кb/AP-1 הפעילות שעתוק בשורה מקרופאג cell מורה בתגובה למגוון של משטחים פולימריים ושכבות חלבון נספחת כי המודל ביומיהמיקרוסביבה השתל ביומטריה.

Abstract

התגובה מארח דלקתי מתמשך ביוביוחומר מושתל, המכונה תגובת גוף זר, הוא אתגר משמעותי בפיתוח ויישום של מכשירים ביו ומבנים הנדסת רקמות. מקרופאגים, תא חיסונית מולדת, הם שחקני מפתח בתגובת הגוף הזר משום שהם נשארים באתר השתל למשך החיים של המכשיר, והוא למדו בדרך כלל כדי להשיג הבנה של תגובה זו מארח מזיקה. חוקרים רבים ביואטיליים הראו כי שכבות חלבון נספחת על חומרים מושתלים להשפיע על התנהגות מקרופאג, ולאחר מכן להשפיע על התגובה המארחת. השיטות במאמר זה מתארים מודל בלתי מתורבת באמצעות שכבות חלבון נספחת המכילים נזק תאי מולקולות על משטחי פולימר משטחים כדי להעריך תגובות מקרופאג. NF-кb/AP-1 עיתונאי מקרופאג קו התא ואת העיבוד המקושר באופן אלקליין פוספספטאז משמש כשיטה מהירה כדי לבחון בעקיפין NF-кb/AP-1 פעילות שעתוק בתגובה לשכבות חלבון מורכבות נספחת המכילים חלבונים בדם הקשורים לנזק דפוסי מולקולרי, כמודל של שכבות החלבון המורכבות הנוצרות על משטחי ביומטריה בvivo.

Introduction

תגובת הגוף הזר (FBR) היא תגובת מארח כרונית שיכולה להשפיע לרעה על הביצועים של חומר או מכשיר מושתל (למשל, התקני משלוחים לסמים, ביוחיישנים), באמצעות שחרור מתמשך של מגשרים דלקתיים ובאמצעות השתלבות בשילוב בין החומר המושתל לבין הרקמה הסובבת1. זה התגובה החיסונית מולדת היא ביוזמת הליך ההשתלה מאופיין על ידי נוכחות ארוכת טווח של תאים חיסוניים מולדים היווצרות קפסולה סיבי סביב השתל1. בהקשר של תגובות מארח חומרים, לאינטראקציות חומרים מקרופאג יש השפעה משמעותית על ההתקדמות של התגובה המארחת ופיתוח של FBR1. מקרופאגים הם האוכלוסייה החיסונית מגוונת מולדים המערכת, גויס לאתר השתל או מתוך רקמות תושב האוכלוסייה מקרופאג או מהדם כמו מקרוציט הנגזרים מונופאגים. הם מתחילים להצטבר באתר השתל זמן קצר לאחר השרשה, ובתוך ימים להפוך לאוכלוסיית התא השולט במיקרו הסביבה השתל. חומר-מקרופאגים, יחד עם הגוף הזר תאים ענקיים (fbgc) נוצר באמצעות מקרופאג fusion, יכול להתמיד במשטח החומר למשך החיים של השתל2,3. כתוצאה מכך, מקרופאגים נחשבים לשחקנים מרכזיים בתגובה לגוף הזר בשל תפקידם מנצח את השלבים האופייניים של FBR: תגובה דלקתית חריפה, שיפוץ רקמות, היווצרות של רקמת פיברוטיק1.

קולטני שיחת כמו (TLRs) הם משפחה של קולטני זיהוי תבנית אשר מבוטאים על ידי תאים חיסוניים רבים, כולל מקרופאגים, והוכחו לשחק תפקיד משמעותי דלקת וריפוי הפצע. בנוסף לליגני הפתוגן, TLRs מסוגלים לאגד מולקולות אנדודוגני, הידועות כתבניות מולקולריות הקשורות נזק (DAMPs), אשר פורסמו במהלך נמק בתא ולהפעיל מסלולים איתות דלקתיות וכתוצאה מכך ייצור ציטוקינים proinflammatory4. אנחנו ואחרים הציעו כי הנזק שנגרם במהלך בדיקת רקמה רכה השתלת שחרור damps, אשר לאחר מכן ספוח כדי ביומטריה בנוסף לחלבונים בדם ולווסת את האינטראקציות חומרים סלולריים הבאים5,6. כאשר מקרופאגים אינטראקציה עם שכבת החלבון נספחת על השתל, משטח שלהם tlrs עשוי לזהות נספחת damps ולהפעיל מפלי איתות proinflammatory, המוביל NF-κB ו AP-1 שעתוק גורם ההפעלה והייצור של ציטוקינים proinflammatory. בעבר הצגנו כי מקרופאגים murine הגדילו באופן משמעותי NF-κB/AP-1 פעילות נמק גורם הגידול α (tnf-α, הפרשת cy, ציטומין) בתגובה לח-המכיל שכבות חלבון נספחת על מגוון של משטחים פולימריים לעומת משטחים עם סרום נספחת או פלזמה בלבד (כלומר, אין damps נוכח), וכי תגובה זו מתווכת במידה רבה על ידי TLR2, בעוד TLR4 משחק תפקיד פחותה5.

הכתב NF-κB/AP-1 מקרופאג line (הטבלה של חומרים) המשמשים בפרוטוקול זה היא שיטה נוחה למדוד יחסי NF-κB ו-AP 1 פעילות ב מקרופאגים5,7,8. בשילוב עם מעכבי מסלול tlr, קו תא זה הוא כלי שימושי עבור חקירת ההפעלה tlr ואת תפקידה בדלקת בתגובה למגוון גירויים5,7,8. התאים עיתונאי הם העכבר שונה מקרופאג כמו קו תא זה יכול לייצר באופן בלתי נשכח פוספספטאז אלקליין עובריים (SEAP) על NF-κB ו-AP-1 הפעלת שעתוק מקדם9. לאחר מכן ניתן להשתמש במיטרי הצביעה האלקליין מסוג פוספספטאז (טבלת חומרים) כדי לכמת כמויות יחסיות של ביטוי seap כאמצעי עקיף של הפעילות NF-ΚB/AP-1. כמו NF-κB ו-AP-1 נמצאים במורד הזרם של מסלולים רבים של איתות תאים, נטרול נוגדנים ומעכבי המיקוד TLRs ספציפיים (למשל, TLR2) או מולקולות TLRS (g., MyD88) ניתן להשתמש כדי לאמת את התפקיד של מסלול מסוים. המתודולוגיה המתוארת במאמר זה מספקת גישה פשוטה ומהירה להערכת התרומה של ה-tlr איתות בתגובות מקרופאג murine למגוון של משטחים פולימריים עם שכבות חלבון נספחת המכילים הן חלבונים בדם ו-damps כמו מודל מבחנה של בדיקות מושתלים מושתל.

Protocol

1. הכנה לתקשורת ומגיב . הכן מדיה בפיברובלסט שילוב 450 mL של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), 50 mL של סרום של שור עוברי (FBS), ו-5 מ ל של פניצילין/סטרפטומיצין. החנות ב -4 ° c עד שלושה חודשים. הכינו כתבת מקרופאג מדיית גדילה ב50 mL. שילוב 45 mL של DMEM, 5 מ ל של FBS, 5 μg/mL mycoplasma אלימינציה מגיב (טבלת חומרים</stro…

Representative Results

שיטות ניקוי עבור משטחים מצופי פולימר נבדקו כדי להבטיח שלא היה הפרעה של ציפוי, אשר ניתן היה לראות כשינוי בזווית מגע המים לתוך שמיכות זכוכית ללא ציפוי (איור 2). הטבילה PMMA מצופה מיקרוסקופ שקופיות 70% אתנול עבור 1 h נמצא כדי להסיר את ציפוי PMMA (איור 2, שמאל פאנל), כנראה…

Discussion

המוקד העיקרי של המעבדה שלנו היא התגובה המארחת על שתלים מוצק רקמת רקמה רכה, ובמיוחד איך הנזק התאי שנגרמו במהלך השתלת הליך משפיע על התגובה המארחת. העבודה המוצגת כאן מתארת ניסויים ראשוניים באמצעות כתבת קו מקרופאג cell באמצעות מבחנה לחות הסלולר המכילים לחות, כדי לחקור את ההשפעה של מולקולות שפור…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מכירים בהכרת תודה מבצעית מהמכונים הקנדיים של פרויקט מחקר הבריאות (PTJ 162251), הסנאט של אוניברסיטת המלכה ועדת המחקר המייעצת ותמיכת תשתית של הקרן הקנדית לחדשנות קרן ג’ון אוון (פרויקט 34137) ומשרד המחקר והחדשנות באונטריו קרן המחקר (פרויקט 34137). L.A.M. היה נתמך על ידי אוניברסיטת המלכה R. סמואל מקלפלין מלגת, מדעי הטבע והמועצה למחקר הנדסי של קנדה בוגרת מלגת בוגר הפרס של מאסטר בוגרת אונטריו מלגה. המחברים רוצים להודות לד ר מיירון סצ’ואן על מתנתו הנדיבה של הכתבת NF-κB/AP-1 מקרופאג line ו ד”ר. מיכאל בלנרסט וסנדרה לורנסו לשימוש מערכת הדמיה ג’ל שלהם וקורא צלחת.

Materials

Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2) Biolegend 121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor) Invivogen TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin InnovativeResearch IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma Aldrich D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Fisher Scientific 14190250 No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade Wisent 98150
LPS-EK Invivogen TLRL-EKLPS Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts ATCC CRL-1658
Pam3CSK4 Invivogen tlrl-pms Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P4333-100ML
Plasmocin Invivogen ANT-MPP Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells Invivogen raw-sp NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
TrypLE express enzyme (1X) Fisher Scientific 12604021 animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin Invivogen ANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6 Biolegend B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α Biolegend B220233
Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) Associates of Cape Cope Inc. E0005-5 Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL Associates of Cape Cope Inc. WP1001 Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay Fisher Scientific PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit Associates of Cape Cope Inc. C1500-5 Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium Invivogen rep-qb2 Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrous Sigma Aldrich 288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous Commercial Alcohols P006EAAN Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent Sigma Aldrich F9755-100ML Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free) Fisher Scientific SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) Sigma Aldrich 182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit Fisher Scientific 50822180
Teflon-AF (fPTFE) Sigma Aldrich 469610-1G Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate seals Fisher Scientific AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps Fisher Scientific 03-337-4
Clear PS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-52
Clear TCPS 96-well plate Fisher Scientific 08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-1C
Cover glasses, circles Fisher Scientific 12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25 Fisher Scientific 10-126-10
sticky-Slide 8 Well Ibidi 80828
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150 Fisher Scientific 08-772-48
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
  2. Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
  3. Collier, T. O., Anderson, J. M. Protein and surface effects on monocyte and macrophage adhesion, maturation, and survival. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (3), 487-496 (2002).
  4. Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. Journal of Leukocyte Biology. 81 (1), 1-5 (2007).
  5. McKiel, L. A., Fitzpatrick, L. E. Toll-like Receptor 2-Dependent NF-κB/AP-1 Activation by Damage-Associated Molecular Patterns Adsorbed on Polymeric Surfaces. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3792-3801 (2018).
  6. Babensee, J. E. Interaction of dendritic cells with biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 101-108 (2008).
  7. Sintes, J., Romero, X., de Salort, J., Terhorst, C., Engel, P. Mouse CD84 is a pan-leukocyte cell-surface molecule that modulates LPS-induced cytokine secretion by macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 88 (4), 687-697 (2010).
  8. Tom, J. K., Mancini, R. J., Esser-Kahn, A. P. Covalent modification of cell surfaces with TLR agonists improves and directs immune stimulation. Chemical Communications. 49 (83), 9618-9620 (2013).
  9. Abdulkhalek, S., et al. Neu1 sialidase and matrix metalloproteinase-9 cross-talk is essential for toll-like receptor activation and cellular signaling. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36532-36549 (2011).
  10. Gorbet, M. B., Sefton, M. V. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 26 (34), 6811-6817 (2005).
  11. Xing, Z., Pabst, M. J., Hasty, K. A., Smith, R. A. Accumulation of LPS by polyethylene particles decreases bone attachment to implants. Journal of Orthopaedic Research. 24 (5), 959-966 (2006).
  12. Ding, H., et al. Comparison of the cytotoxic and inflammatory responses of titanium particles with different methods for endotoxin removal in RAW264.7 macrophages. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 23 (4), 1055-1062 (2012).
  13. Hoogenboom, R., Becer, C. R., Guerrero-Sanchez, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Solubility and thermoresponsiveness of PMMA in alcohol-water solvent mixtures. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1173-1178 (2010).
  14. Efimenko, K., Wallace, W. E., Genzer, J. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 254 (2), 306-315 (2002).
  15. Godek, M. L., Sampson, J. A., Duchsherer, N. L., McElwee, Q., Grainger, D. W. Rho GTPase protein expression and activation in murine monocytes/macrophages is not modulated by model biomaterial surfaces in serum-containing in vitro cultures. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 17 (10), 1141-1158 (2006).
  16. Park, J. S., et al. Involvement of Toll-like Receptors 2 and 4 in Cellular Activation by High Mobility Group Box 1 Protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (9), 7370-7377 (2004).
  17. Ohashi, K., Burkart, V., Flohé, S., Kolb, H. Cutting Edge: Heat Shock Protein 60 Is a Putative Endogenous Ligand of the Toll-Like Receptor-4 Complex. The Journal of Immunology. 164 (2), 558-561 (2000).
  18. Wong, T., McGrath, J. A., Navsaria, H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. British Journal of Dermatology. 156 (6), 1149-1155 (2007).
  19. van Wachem, P. B., et al. The influence of protein adsorption on interactions of cultured human endothelial cells with polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 21 (6), 701-718 (1987).
  20. Miller, K. M., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage activation and interleukin 1 generation by biomedical polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 22 (8), 713-731 (1988).
  21. Bonfield, T. L., Colton, E., Anderson, J. M. Plasma protein adsorbed biomedical polymers: Activation of human monocytes and induction of interleukin 1. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (6), 535-548 (1989).
  22. González, O., Smith, R. L., Goodman, S. B. Effect of size, concentration, surface area, and volume of polymethylmethacrylate particles on human macrophages in vitro. Journal of Biomedical Materials Research. 30 (4), 463-473 (1996).
  23. Anderson, J. M., et al. Protein adsorption and macrophage activation on polydimethylsiloxane and silicone rubber. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 7 (2), 159-169 (1995).
  24. Lord, M. S., Foss, M., Besenbacher, F. Influence of nanoscale surface topography on protein adsorption and cellular response. Nano Today. 5 (1), 66-78 (2010).
  25. Chen, S., et al. Characterization of topographical effects on macrophage behavior in a foreign body response model. Biomaterials. 31 (13), 3479-3491 (2010).
  26. Shen, M., Horbett, T. A. The effects of surface chemistry and adsorbed proteins on monocyte/macrophage adhesion to chemically modified polystyrene surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 57 (3), 336-345 (2001).
  27. Love, R. J., Jones, K. S. The recognition of biomaterials: Pattern recognition of medical polymers and their adsorbed biomolecules. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (9), 2740-2752 (2013).
  28. McNally, A. K., Anderson, J. M. Phenotypic expression in human monocyte-derived interleukin-4-induced foreign body giant cells and macrophages in vitro: Dependence on material surface properties. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1380-1390 (2015).
  29. Gambhir, V., et al. The TLR2 agonists lipoteichoic acid and Pam3CSK4 induce greater pro-inflammatory responses than inactivated Mycobacterium butyricum. Cellular Immunology. 280 (1), 101-107 (2012).
  30. Suzuki, O., Yagishita, H., Yamazaki, M., Aoba, T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Octacalcium Phosphate and its Hydrolyzates. Cells and Materials. 5 (1), 45-54 (1995).
  31. Johnston, R. L., Spalton, D. J., Hussain, A., Marshall, J. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 25 (8), 1109-1115 (1999).
  32. Jin, J., Jiang, W., Yin, J., Ji, X., Stagnaro, P. Plasma proteins adsorption mechanism on polyethylene-grafted poly(ethylene glycol) surface by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 29 (22), 6624-6633 (2013).
  33. Swartzlander, M. D., et al. Linking the foreign body response and protein adsorption to PEG-based hydrogels using proteomics. Biomaterials. 41, 26-36 (2015).
  34. Chamberlain, M. D., et al. Unbiased phosphoproteomic method identifies the initial effects of a methacrylic acid copolymer on macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (34), 10673-10678 (2015).
  35. Dillman, W. J., Miller, I. F. On the adsorption of serum proteins on polymer membrane surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 44 (2), 221-241 (1973).
  36. Ishihara, K., Ziats, N. P., Tierney, B. P., Nakabayashi, N., Anderson, J. M. Protein adsorption from human plasma is reduced on phospholipid polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (11), 1397-1407 (1991).
  37. Warkentin, P., Wälivaara, B., Lundström, I., Tengvall, P. Differential surface binding of albumin, immunoglobulin G and fibrinogen. Biomaterials. 15 (10), 786-795 (1994).
  38. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 33 (5), 443-454 (2010).
  39. Zhang, Y., Karki, R., Igwe, O. J. Toll-like receptor 4 signaling: A common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 (HMGB1) protein-coupled activation. Biochemical Pharmacology. 98 (1), 132-143 (2015).
  40. Mizel, S. B., Honko, A. N., Moors, M. A., Smith, P. S., West, A. P. Induction of macrophage nitric oxide production by Gram-negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll-like receptor 5/Toll-like receptor 4 complexes. Journal of Immunology. 170 (12), 6217-6223 (2003).
  41. Das, N., et al. HMGB1 Activates Proinflammatory Signaling via TLR5 Leading to Allodynia. Cell Reports. 17 (4), 1128-1140 (2016).
  42. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 Receptor Differentially Couples to Distinct Release Pathways for IL-1β in Mouse Macrophage. The Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  43. Tak, P. P., Firestein, G. S. NF-κB: A key role in inflammatory diseases. Journal of Clinical Investigation. 107 (1), 7-11 (2001).
  44. Ashkenazi, A., Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281 (5381), 1305-1308 (1998).
  45. Erridge, C. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants. Journal of Leukocyte Biology. 87 (6), 989-999 (2010).
  46. Feng, Y., et al. A macrophage-activating, injectable hydrogel to sequester endogenous growth factors for in situ angiogenesis. Biomaterials. 134, 128-142 (2017).
  47. Lonez, C., et al. Cationic lipid nanocarriers activate Toll-like receptor 2 and NLRP3 inflammasome pathways. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 10 (4), 775-782 (2014).

Tags

Macrophage Reporter Cell AssayToll-like ReceptorNF-kBAP-1SignalingAdsorbed Protein LayersPolymeric SurfacesPMMASpin Coating3T3 Cell LysatesCell CultureCell Dissociation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image