Lesión de la médula espinal de la contusión a través de una laminectomía microquirúrgica en el Axolotl regenerativo
Summary
Este manuscrito presenta protocolos para infligir quirúrgicamente lesiones de médula espinal controladas y afiladas a un axolotl regenerativo (Ambystoma mexicanum).
Abstract
El propósito de este estudio es establecer un modelo estandarizado y reproducible de lesión de la médula espinal contundente regenerativa en el axolotl (Ambystoma mexicanum). La mayoría de las lesiones clínicas de la médula espinal se producen como traumatismos contundentes de alta energía, lo que induce lesiones por contusión. Sin embargo, la mayoría de los estudios en la médula espinal axolotl se han realizado con traumas agudos. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo producir un modelo regenerativo más relevante clínicamente. Debido a su impresionante capacidad para regenerar casi cualquier tejido, los axolotls son ampliamente utilizados como modelos en estudios regenerativos y se han utilizado ampliamente en estudios de lesión de la médula espinal (SCI). En este protocolo, los axolotls son anestesiados por inmersión en una solución de benzocaína. Bajo el microscopio, se realiza una incisión angular bilateralmente a un nivel justo caudal a las extremidades posteriores. A partir de esta incisión, es posible diseccionar y exponer los procesos espinosos. Usando fórceps y tijeras, se realiza una laminectomía de dos niveles, exponiendo la médula espinal. Se construye un dispositivo de trauma personalizado que consiste en una varilla que cae en un cilindro, y este dispositivo se utiliza para inducir una lesión de contusión en la médula espinal. Las incisiones se suturan y el animal se recupera de la anestesia. El enfoque quirúrgico es exitoso en la exposición de la médula espinal. El mecanismo de traumatismo puede producir lesiones por contusión en la médula espinal, como lo confirma la histología, la resonancia magnética y el examen neurológico. Finalmente, la médula espinal se regenera a partir de la lesión. El paso crítico del protocolo es eliminar los procesos espinosos sin infligir daño a la médula espinal. Este paso requiere capacitación para garantizar un procedimiento seguro. Además, el cierre de la herida depende en gran medida de no infligir daños innecesarios a la piel durante la incisión. El protocolo se realizó en un estudio aleatorizado de 12 animales.
Introduction
El objetivo general de este estudio fue establecer un método microquirúrgico controlado y reproducible para infligir SCI contundente y agudo al axolotl (Ambystoma mexicanum), produciendo un modelo de lesión regenerativa de la médula espinal.
El Lico de SCI es una afección grave que, dependiendo del nivel y la extensión, inflige discapacidad neurológica a las extremidades junto con deterioro de la vejiga y el control intestinal1,2,3. La mayoría de sCI son el resultado de traumas contundentes de alta energía como accidentes de tráfico y caídas4,5. Las lesiones bruscadas son muy raras. Por lo tanto, el tipo de lesión macroscópica más común son las contusiones.
El sistema nervioso central de los mamíferos (SNC) es un tejido no regenerativo, por lo tanto no se ve restauración del tejido neurológico después de SCI6,7,8. Por otro lado, algunos animales tienen una capacidad intrigante para regenerar tejidos, incluyendo el tejido del SNC. Uno de estos animales es el axolotl. Es ampliamente utilizado en estudios de biología regenerativa y es de interés en la regeneración de la médula espinal, ya que es un vertebrado9,10,11,12.
La mayoría de los estudios de SCI en el axolotl se realizan como amputación de toda la cola o ablación de una mayor parte de la médula espinal9,10,11,12. Recientemente, se publicó un nuevo estudio sobre lesiones contundentes13 que imita mejor las situaciones clínicas. Mientras que la amputación completa del apéndice en el axolotl da lugar a una regeneración completa, algunos fenómenos regenerativos no basados en la amputación dependen del defecto de tamaño crítico (CSD)14,15. Esto significa que las lesiones que superan un umbral crítico no se regeneran. Para desarrollar un modelo regenerativo con un mayor valor traslacional clínico, este estudio investigó si un traumatismo contundente de 2 mm superaría el límite de DSA.
Este método es relevante para los investigadores que trabajan en la regeneración de la médula espinal en modelos animales pequeños, especialmente en el axolotl. Además, puede ser de mayor interés general, ya que exhibe una forma de utilizar equipos de laboratorio estándar para desarrollar un mecanismo de trauma contundente que sea adecuado para su uso en animales pequeños en general.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a que el riesgo de lesión en la médula espinal es significativo, los pasos críticos del protocolo son la eliminación de los procesos espinosos y el ensanchamiento del acceso óseo al canal espinal si es necesario. Como se mencionó en el protocolo, se recomienda eliminar primero el proceso más craneal. Esto significará que cuantos más procesos caudales protejan la médula espinal de ser golpeada por las tijeras. Se recomienda asegurar suficiente acceso quirúrgico, lo que significa no hacer una incisión pr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Michael Pedersen, de la Universidad de Aarhus por su experiencia y tiempo en el desarrollo de protocolos de RMN y la creación de todo el proyecto. Peter Agger, de la Universidad de Aarhus por su experiencia y tiempo en el desarrollo de los protocolos de RMN. Steffen Ringgard, de la Universidad de Aarhus por su experiencia y tiempo en el desarrollo de los protocolos de RMN. El desarrollo del modelo SCI en el axolotl fue apoyado amablemente por la Fundación A.P. M’ller Maersk, la Fundación Riisfort, la Fundación Linex y la Fundación ELRO.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
Referências
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