בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד
Summary
אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.
Abstract
כמו מקרופאגים תושב במערכת העצבים המרכזית, מיקרוגלייה פעיל שליטה בפיתוח המוח הומאוסטזיס, ואת התפקוד שלהם יכול לנהוג במחלות אנושיות. מקדמות רבות נעשו כדי לחשוף את החתימות המולקולריות של מיקרוגלייה הומטיק, כמו גם שינויים של הביטוי הגנטי שלהם בתגובה לגירויים סביבתיים. עם הופעתו והתבגרות של תא בודד מתודולוגיות גנומית, הוא מוכר יותר ויותר כי מיקרוגלייה הטרוגניים עשוי להיות מתחת לתפקידים מגוונים הם משחקים בתנאים התפתחותיים ופתולוגיים שונים. ניתוח נוסף של טרוגניות כזה יכול להיות מושגת באמצעות בידוד יעיל של מיקרוגלייה מתוך אזור נתון של עניין, ואחריו פרופיל רגיש של תאים בודדים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד מהיר של מיקרוגלייה מאזורי מוח שונים בחצי הכדור המוח העכבר המבוגר. אנו גם להדגים כיצד להשתמש מיקרוגלייה אלה מיון עבור מבוסס צלחת תא יחיד ברצף RNA רצפי. אנו דנים על הסתגלות של שיטה זו לתרחישים אחרים ולספק הנחיות לשיפור המערכת כדי להתאים למחקרים בקנה מידה גדול.
Introduction
Microglia, המייצג 5% על 10% של כל התאים העצביים, הם מקרופאגים המתמחים מפוזרים ברחבי מערכת העצבים המרכזית (CN)1. מוגן מאחורי מחסום דם-מוח, מיקרוגלייה אופייני במוח מבוגר בריא להכיל תהליכים עדינים רבים במהירות להאריך ולסגת כדי אינטראקציה עם נוירונים ותאי גליה אחרים בתוך הכימומה. Microglia יכול גם לאמץ את מורפולוגיה אמבות הקשורים בפונקציה phagocytic מוגברת במהלך שלבים התפתחותיים ספציפיים או על האתגרים החיסונית פציעה ומחלה1,2,3,4. תגליות מרגש לאחרונה הפגינו בבירור כי מיקרוגלייה הם בשום מקרה פסיבי עוברי אורח פסיבית המוח או אותות פתולוגיים, אבל לשחק תפקידים מרכזי בשליטה המוח התפתחות הומאוסטזיס, למשל, על ידי תמיכה הישרדות עצבי, גיזום הסינפסות בלתי האוליגודנדרוציטים, קידום תאים השושלת היוחסין בידול, כמו גם אנגיוגנזה1. ככל פונקציות יותר של מיקרוגלייה מובהר, ההתרגשות היא נוספת מונעת על ידי מחקרים גנטיקה של האדם, אשר הראו כי הרבה מחלות נוירוניווניות הסיכון גנים, כגון TREM2, הם בעיקר או בלעדית מבוטא על ידי מיקרוגלייה5,6,7. בהתחשב במשמעות שלהם בפיתוח וסביר מחלות נהיגה תפקידים, מאמץ עצום לאחרונה הושם לקראת ההבנה שלנו של רגולציה גנטית microglial ותפקוד בתקווה למצוא מטרות טיפוליות חדשות עבור מחלות ניווניות1,8.
רצפי RNA (RNA-seq) מאפשר אפיון לא משוחד של הביטוי הגן הספציפי לסוג תא, אשר בתורו המדריכים מדענים לחקור פונקציות גן ברשתות הסלולר צפוף7. RNA-seq נעשה בעיקר על דגימות בצובר, המוביל לגילוי של חתימת גנים microglial הומאטית המבדיל אותם מתאים עצביים אחרים החיסונית9. עם זאת, גישה כזו יכולה להתעלם הבדלים מולקולריים ופונקציונליים בקרב microglia, במיוחד אלה הנוכחים בפיתוח, או הקשורים הזדקנות ומחלות. אכן, תא בודד RNA-seq (scRNA-seq) מציע את הרגישות ואת הרזולוציה כי יש מהפכה בשדה על ידי חשיפת בעבר העריכה הטרוגניות של מיקרוגלייה במגוון של ההקשרים2,3,10. בנוסף, בשל נוכחותם של תאים אחרים החיסונית דומים בממשק מחזור המערכת, scRNA-seq מספק מידע לסייע לעיצוב של כלים חדשים כדי להפריד ולנתח פונקציונלית אלה תאים הקשורים עם מעט לפני ידע2,11.
מערך מגוון של פלטפורמות scRNA-seq הומצאו, כל אחד מתאים יישומים מסוימים12. באופן כללי, שיטות המבוססות על droplet, כגון: x גנומיקה, גבוהות יותר בתפוקה עם (עשרות) אלפי תאים ברצף בכל הפעלה, והם פחות סלקטיבית עבור הקלט שעשוי להכיל אוכלוסיות תאים מעורבות הדורשות סיווג נרחב. שיטות מבוססות לוח לספק רגישות גבוהה יותר לקרוא עומק13,14, בדרך כלל מיקוד אוכלוסיות ספציפיות ממיון התא כדי לחשוף הבדלים עדינים או תעתיקים נדירים. בהינתן אחוז קטן של תאים microglial, במיוחד אלה התפתחות-או מחלות הקשורות אוכלוסיות, בין כל סוגי התאים של ה-cn, זה לעתים קרובות רצוי לבודד מיקרוגלייה מאזור מסוים של עניין ולקבל מידע עמוק ובאורך מלא ההמרה על מנת להבין את טרוגניות.
כאן, אנו מספקים פרטים על איך לבודד מיקרוגלייה מאזורים שונים במוח העכבר גזור מאונה אחת, אשר משמשים עבור תא בודד (או בצובר) RNA-seq בעקבות הליך הכנה חצי אוטומטי המבוסס על לוח הספריה. לאחר מכן ניתן להשתמש בחצי הכדור השני לאימות היסטולוגית. באופן יעיל משיטה שפורסמה בעבר9, פרוטוקול בידוד זה שואפת למקסם את התשואה מכמות קטנה של חומרי ההתחלה, ובינתיים לשמור על פרופילי מיקרוגליאל גנטי ביטויים. אנו משתמשים מיון תא מופעל-פלואורסצנטית (facs) כדי להעשיר מיקרוגלייה (או תאים אחרים הקשורים החיסונית של עניין) לתוך 96-ובכן צלחות ממזער את הכרכים של ריאגנטים להכנת הספריה כדי להגדיל את התפוקה. אנו מדגישים את פלטפורמת scRNA-seq הרגישה הזאת, למרות שניתן ליישם אסטרטגיות אחרות המבוססות על צלחת. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לבידוד מיקרוגלייה מרקמות אחרות, כגון פציעה או מחלה, וגיל העכבר יכול להשתנות כמעט בכל שלבי הלידה. בידוד יעיל של מיקרוגלייה אזוריים למחקרים בעלי תא יחיד הטרנססקריפט יסייע להבנה טובה יותר של התפקודים שלהם בריאות ומחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia אינטראקציה פעילה עם סוגי תאים אחרים ב-CN, והם רגישים מאוד גירויים סביבתיים. על מנת למזער תגובות דלקתיות שינויים ביטוי הגנים שלהם במהלך תהליך הבידוד, פרוטוקול זה היה יעיל מתוך שיטה שפורסמה בעבר9, והוא מתאים כעת לבודד מיקרוגלייה מאזורים מרובים של המוח בודד בצורת העכבר במקבי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למריקו ל. בנט, ליאנה ניקול בונאנו, ו Spyros דארמני על עזרתם במהלך פיתוח פרוטוקול זה. אנו מודים גם למתקן ה-FACS המשותף של סטנפורד, במיוחד מרדית ווגלז וליסה ניקולס; ין טראן, מייקל Eckart מאוניברסיטת סטנפורד וחומצות גרעין מתקן (פאן) על התמיכה הגדולה שלהם לצילום. עבודה זו ממומנת על ידי קרן JPB ו וינסנט ג’יי קוטס.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
Referências
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
- Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
- Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
- Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), 79-89 (2018).
