Etikettierung und Bildgebung von Amyloid-Plaques im Gehirngewebe mit dem natürlichen Polyphenol Curcumin
Summary
Curcumin ist ein ideales Fluorophor für die Kennzeichnung und Bildgebung von Amyloid-Beta-Protein-Plaques im Gehirngewebe aufgrund seiner bevorzugten Bindung an Amyloid-Beta-Protein sowie seiner strukturellen Ähnlichkeiten mit anderen traditionellen Amyloid-Bindungsfarbstoffen. Es kann verwendet werden, um Amyloid-Beta-Protein-Plaques effizienter und kostengünstiger als herkömmliche Methoden zu beschriften und abzubilden.
Abstract
Die Ablagerung von Amyloid-Beta-Proteinen (A) in extra- und intrazellulären Räumen ist eine der charakteristischen Pathologien der Alzheimer-Krankheit (AD). Daher ist der Nachweis des Vorhandenseins von Aa im AD-Gehirngewebe ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden, um das Fortschreiten von AD zu verhindern. Mehrere klassische Amyloid-Bindungsfarbstoffe, Fluorchrom, bildgebende Sonden und A-spezifische Antikörper wurden verwendet, um Aa histochemisch im AD-Gehirngewebe zu detektieren. Die Verwendung dieser Verbindungen für die A-Erkennung ist kostspielig und zeitaufwändig. Aufgrund seiner intensiven fluoreszierenden Aktivität, der hohen Affinität und der Spezifität von Aa sowie struktureller Ähnlichkeiten mit traditionellen Amyloid-Bindungsfarbstoffen ist Curcumin (Cur) jedoch ein vielversprechender Kandidat für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques in postmortem Hirngewebe. Es ist ein natürliches Polyphenol aus dem Kraut Curcuma longa. In der vorliegenden Studie wurde Cur verwendet, um A-Plaques sowohl aus einem genetischen Mausmodell der 5x familiären Alzheimer-Krankheit (5xFAD) als auch aus menschlichem AD-Gewebe innerhalb einer Minute histochemisch zu kennzeichnen. Die Etikettierfähigkeit von Cur wurde mit herkömmlichen Amyloid-Bindungsfarbstoffen wie Thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR) und Fluoro-jade C (FJC) sowie A-spezifischen Antikörpern (6E10 und A11) verglichen. Wir beobachteten, dass Cur der preiswerteste und schnellste Weg ist, A-Plaques im Vergleich zu diesen herkömmlichen Farbstoffen zu beschriften und abzubilden und mit A-spezifischen Antikörpern vergleichbar ist. Darüber hinaus bindet Cur mit den meisten A-Arten, wie Oligomere und Fibrillen. Daher könnte Cur als kostengünstigstes, einfachstes und schnellstes Fluorchrom-Detektionsmittel für A-Plaques verwendet werden.
Introduction
Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine der häufigsten, altersbedingten, fortschreitenden neurologischen Erkrankungen und eine der häufigsten Todesursachen weltweit1,2. Lern-, Gedächtnis- und Kognitionsstörungen, zusammen mit neuropsychiatrischen Störungen, sind die häufigsten Symptome, die sich in AD3manifestieren. Obwohl die Ätiologie von AD noch nicht vollständig aufgeklärt wurde, deuten die verfügbaren genetischen, biochemischen und experimentellen Beweise darauf hin, dass die allmähliche Ablagerung von Aa ein endgültiger Biomarker für AD4ist. Dieses falsch gefaltete Protein sammelt sich in intrazellulären und extrazellulären Räumen an und wird angenommen, dass es an synaptischen Verlusten, erhöhter Neuroinflammation und Neurodegeneration in den kortikalen und hippocampalen Regionen im Gehirn beteiligt ist, die von AD5betroffen sind. Daher ist der histochemische Nachweis von Aa im AD-Gewebe ein entscheidender erster Schritt bei der Entwicklung ungiftiger Anti-Amyloid-Medikamente zur Verhinderung der AD-Progression.
In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Farbstoffe und Antikörper von vielen Forschungslaboratorien verwendet, um A-Plaques im Hirngewebe zu kennzeichnen und abzubilden, aber einige dieser Methoden sind zeitaufwändig und die verwendeten Farbstoffe oder Antikörper sind teuer, was mehrere Zubehörteile erfordert. Chemikalien. Daher wäre die Entwicklung eines kostengünstigen Nachweismittels für A-Plaques im AD-Gehirn ein willkommenes neues Werkzeug. Viele Laboratorien begannen mit Cur, einem vielversprechenden Anti-Amyloid-Naturpolyphenol, für die Kennzeichnung und Bildgebung von A, sowie einem therapeutischen Mittel für AD6,7,8,9. Seine Hydrophobie und lypophile Natur, strukturelle Ähnlichkeiten mit klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffen, starke fluoreszierende Aktivität, sowie eine starke Affinität zur Bindung mit Aa macht es zu einem idealen Fluorophor für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques im AD-Gewebe10 . Cur bindet mit A-Plaques und Oligomeren und seine Anwesenheit wird auch in intrazellulären Räumen7,11,12,13nachgewiesen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass minimale Mengen (1x 10 nM) von Cur A-Plaques bei 5x familiärer Alzheimer-Krankheit (5xFAD) Hirngewebe7beschriften können. Obwohl die 1 nM-Konzentration nicht die optimale Fluoreszenzintensität für die Zählung von A-Plaques liefert, ist eine 10 nM oder höhere Konzentration von Cur nicht. Ran und Kollegen14 berichteten, dass Dosen von bis zu 0,2 nM difluoroboron-derivatisierter Kur in vivo A-Ablagerungen fast so gut wie eine Infrarotsonde erkennen können. Ob diese Dosis ausreicht, um A-Plaques im Gewebe zu kennzeichnen, ist noch unklar. Die meisten früheren Studien haben 20-30 min für die Färbung von A-Plaques mit Cur verwendet, aber eine optimale Färbung kann viel weniger Zeit in Sicherstellung enden.
Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um die minimale Zeit zu testen, die Cur benötigt, um A-Plaques im AD-Gehirngewebe zu kennzeichnen und die Empfindlichkeit für die Kennzeichnung und Bildgebung von A-Plaques im Hirngewebe von den 5xFAD-Mäusen nach der Färbung mit Cur mit anderen konventionellen Bindende Farbstoffe wie Thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR) und Fluoro-jade C (FJC). Die A-Etikettierungsfähigkeit dieser klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffe wurde mit Der Färbung in paraffin-eingebetteten und kryostatkoronalen Hirnabschnitten von 5xFAD-Mäusen und aus altersgerechten menschlichen AD und der Kontrolle des Hirngewebes verglichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cur-Plaques in einer Weise, die A-spezifischen Antikörpern (6E10) und mäßig besser als Thio-S, CR oder FJC ähnelt. Darüber hinaus, wenn intraperitoneale Injektionen von Cur an 5xFAD Mäuse für 2-5 Tage verabreicht wurden, überquerte es die Blut – Hirn-Schranke und gebunden mit A- Plaques7. Interessanterweise wurden nanomolare Konzentrationen von Cur verwendet, um A-Plaques in 5xFAD Hirngewebe7,14zu beschriften und abzubilden. Darüber hinaus können morphologisch unterschiedliche A-Plaques, wie Kern-, neuritische, diffuse und ausgebrannte Plaques, durch Cur effizienter gekennzeichnet werden als bei jedem anderen konventionellen Amyloid-Bindungsfarbstoff7. Insgesamt kann Cur auf die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques in postmortem Hirngewebe aus AD-Tiermodellen und/oder menschlichem AD-Gewebe auf einfache und kostengünstige Weise angewendet werden, als zuverlässige Alternative zu A-spezifischen Antikörpern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere Hypothese war, dass Cur als schnellste, einfachste und kostengünstigste Methode verwendet werden könnte, um A-Plaques im postmortalen AD-Gehirngewebe im Vergleich zu anderen klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffen sowie A-spezifischen Antikörpern zu beschriften und abzubilden. Ziel dieser Studie war es, die Mindestzeit für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques durch Cur im postmortalen AD-Gehirngewebe zu bestimmen und zu bestimmen, ob Cur als Alternative zum A-Antikörper zur Kennzeichnung von A-Plaque…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützung für diese Studie kam vom Field Neurosciences Institute at Ascension of St. Mary es.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1×70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
Referências
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