Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie
Summary
Collectieve Celmigratie in ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen wordt vaak geleid door de gradiënten van groeifactoren of signalering van moleculen. Hier beschreven is een experimenteel systeem dat tractie microscopie combineert met een microfluïdisch systeem en een demonstratie van het kwantificeren van de mechanica van collectieve migratie onder biochemische gradiënt.
Abstract
Cellen veranderen migratiepatronen in reactie op chemische stimuli, met inbegrip van de hellingen van de stimuli. Cellulaire migratie in de richting van een chemische gradiënt, bekend als chemotaxis, speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling, de immuunrespons, wondgenezing en kanker metastasen. Terwijl chemotaxis de migratie van enkelvoudige cellen en verzamelingen van cellen in vivo moduleert, is in vitro onderzoek gericht op eencellige chemotaxis, deels als gevolg van het ontbreken van de juiste experimentele gereedschappen. Om die kloof te dichten, hier beschreven, is een uniek experimenteel systeem dat microfluïdica en micropatterning combineert om de effecten van chemische gradiënten op collectieve Celmigratie aan te tonen. Bovendien worden tractie microscopie en monolaag stress microscopie in het systeem opgenomen om veranderingen in cellulaire kracht op het substraat en tussen naburige cellen te karakteriseren. Als proof-of-concept, de migratie van micro patroon circulaire eilanden van Madin-Darby Canine nier (MDCK) cellen wordt getest onder een gradiënt van hepatocyte groeifactor (HGF), een bekende verstrooiing factor. Het is gevonden dat cellen in de buurt van de hogere concentratie van HGF sneller migreren dan die aan de andere kant binnen een celeiland. Binnen hetzelfde eiland, cellulaire tractie is vergelijkbaar aan beide zijden, maar intercellulaire stress is veel lager aan de kant van hogere HGF concentratie. Dit nieuw experimentele systeem kan nieuwe mogelijkheden bieden om de mechanica van Chemotactische migratie door cellulaire collectieven te bestuderen.
Introduction
Cellulaire migratie in biologische systemen is een fundamenteel fenomeen betrokken bij weefselvorming, de immuunrespons, en wondgenezing1,2,3. Cellulaire migratie is ook een belangrijk proces in sommige ziekten zoals kanker4. Cellen migreren vaak als een groep in plaats van afzonderlijk, die bekend staat als collectieve cel migratie4,5. Voor cellen om collectief te bewegen, is de detectie van de micro-omgeving essentieel6. Cellen waarnemen bijvoorbeeld fysisch-chemische stimuli en reageren door veranderende beweeglijkheid, celsubstraat interacties en celcelinteracties, resulterend in directionele migratie langs een chemische gradiënt7,8, 9,10. Op basis van deze verbinding zijn er snelle ontwikkelingen gemaakt in lab-on-a-chip-technologieën die goed gecontroleerde chemische micro omgevingen kunnen creëren, zoals de gradiënt van een chemoaantretant11,12,13 . Hoewel deze Lab-op-een-chip-gebaseerde microfluïdica eerder zijn gebruikt om chemotaxis van het cellulaire Ensemble of cellulaire sferoïden14,15,16,17te bestuderen, zijn meestal gebruikt in de context van eencellige migratie18,19,20,21. Mechanismen die aan een cellulaire collectieve respons op een chemische gradiënt ten grondslag liggen, zijn nog steeds niet goed begrepen14,22,23,24,25,26 . Zo zal de ontwikkeling van een platform dat de spatiotemporele controle van oplosbare factoren mogelijk maakt, evenals in situ observatie van cellen biofysische, helpen om de mechanismen achter collectieve Celmigratie te ontrafelen.
Ontwikkeld en beschreven hier is een multi-channeled microfluïdisch systeem waarmee het genereren van een concentratie gradiënt van oplosbare factoren die de migratie van patroon celclusters moduleert. In deze studie wordt hepatocyte growth factor (HGF) gekozen om het migratie gedrag van Madin-Darby Canine nier (MDCK) cellen te reguleren. Hgf staat erom bekend dat de celcelintegriteit wordt verzwakt en de beweeglijkheid van cellen27,28wordt verbeterd. In het microfluïdische systeem worden ook Fourier-transformatie tractie microscopie en monolaag stress microscopie verwerkt, waardoor de beweeglijkheid, de contracactielkracht en de intercellulaire spanning geïnduceerd door samenstellende cellen in reactie op een hgf Verloop. Binnen hetzelfde eiland migreren cellen in de buurt van de hogere concentratie van HGF sneller en vertonen lagere intercellulaire stress niveaus dan die op de zijkant met lagere HGF-concentratie. De resultaten suggereren dat dit nieuwe experimentele systeem geschikt is om andere vragen te onderzoeken op gebieden met betrekking tot collectieve cellulaire migratie onder chemische gradiënten van verschillende oplosbare factoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Collectieve migratie van samenstellende cellen is een belangrijk proces tijdens de ontwikkeling en regeneratie, en de migratie richting wordt vaak geleid door de chemische gradiënt van groeifactoren4,23. Tijdens de collectieve migratie houden cellen interactie met naburige cellen en onderliggende substraten. Dergelijke mechanische interacties geven aanleiding tot opkomende verschijnselen zoals durotaxis42, plithotaxis33<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIP) (nr. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant, en het BK 21 plus programma. Het werd ook gesteund door de National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
Referências
- Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
- Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
- Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
- Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
- Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
- Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
- Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
- Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
- Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
- Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 041918 (2010).
- Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
- Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
- Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
- Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
- Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
- Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).
